[发明专利]一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法

说明书

本发明公开了一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法。其包括：胶原多肽探针的设计，设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的((Gly‑Pro‑Hyp)n或(Gly‑Pro‑Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；胶原多肽探针的制备，通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；胶原纤维染色；体外成像。本发明设计的胶原多肽探针制备简单，检测方便，无生物毒性，能特异性的结合胶原蛋白，在肿瘤，关节炎等胶原蛋白相关疾病的早期检测与疗效评价等领域具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

胶原蛋白作为哺乳动物体内最丰富的的蛋白，是细胞外基质的主要组成成分，在组织形成和维持体内平衡中起到关键作用。当胶原蛋白的产生和降解平衡遭到破坏时，会引起诸多疾病，其中一些疾病可能致命。在胶原重建过程中，若胶原产生过剩，过量的胶原在器官中累积，易产生组织纤维化，最终导致肿瘤等严重疾病；或者胶原不可控降解导致胶原蛋白退化性疾病，如关节炎。在诸多病理条件中，胶原蛋白分子的三重螺旋结构被蛋白酶在细胞外环境中酶解。因此，设计和制备能特异性识别胶原蛋白的探针对这些疾病的诊断和治疗具有重要意义。目前，已研发出一些短肽和抗体用于胶原蛋白的识别及成像，但是，这些检测方法存在价格昂贵，操作复杂，特异性差，结合能力弱等缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法。本方法是利用特定序列的胶原多肽可以特异性的结合部分解链的胶原蛋白，特异性好、结合能力强、制备简单，检测方便，无生物毒性。

本发明的一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法，其包括以下步骤：

(1)胶原多肽探针的设计

设计特定氨基酸序列的胶原多肽，包括:①、中间含有较多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重复序列，以帮助多肽可以与胶原蛋白特异性结合；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；

(2)胶原多肽探针的制备

通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再使用发光物质修饰该胶原多肽；

(3)胶原纤维染色

在胶原纤维分散液中加入胶原多肽探针溶液，4℃孵育3h，离心弃上清液，用1xPBS洗掉未结合探针；

(4)体外成像

在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1x PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；

(5)体内成像

将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。

所述步骤(1)中胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)n(n为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)n(n为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)m(n和m为1-20之间的整数)，或(Gly-Pro-Pro)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)m(n和m为1-20之间的整数)中的一种；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸。