[发明专利]一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针及其制备和成像方法

权利要求书

1.一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针的制备和成像方法，所述方法为：

（1）胶原多肽探针的设计

设计特定氨基酸序列的胶原多肽，所述胶原多肽的序列为(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Amp(-FAM)-(Gly-Pro-Hyp)3，其中FAM为羧基荧光素，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸；

（2）胶原多肽探针的制备

通过固相合成法，合成特定序列的胶原多肽，再将FAM修饰到所述胶原多肽的Amp侧链上；

（3）胶原纤维染色

在胶原纤维分散液中加入胶原多肽探针溶液，4℃孵育3h，离心弃上清液，用1×PBS洗掉未结合探针；

（4）体外成像

在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μL DAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1×PBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；

（5）体内成像

将胶原多肽探针溶于已灭菌的含半胱氨酸的1×PBS中，将其注射入到实验活体内，将活体动物麻醉后放入成像装置中进行成像试验。

2.根据权利要求1所述一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针的制备和成像方法，其特征在于，所述步骤（2）中多肽固相合成的具体方法为：

a) 将80-120mg的树脂加入到具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；

b) 由15-25%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；

c) 将N端Fmoc保护的氨基酸4eq与HOBT 4eq和HBTU 4eq由DMF溶解，低温活化10-30min，向溶液中滴加DIEA 6eq，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；

d) 反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25%哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

e) 之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30%乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；

f) 树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；

g) 向反应液中加入冰乙醚，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反应液相色谱纯化得纯肽；

h) 将20-30mg纯肽由DMF溶解，称取荧光物质4eq、HOBT 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；

i) 将反应液加入冰乙醚中，得到黄色沉淀，黄色沉淀由水溶解并透析除去荧光物质，然后将溶液冻干得到探针。

3.根据权利要求1所述一种特异性识别胶原蛋白的胶原多肽探针的制备和成像方法，其特征在于，所述步骤（3）中胶原纤维由Ⅰ型胶原醋酸溶液在NaCl溶液中透析得到，将0.5-1.5mg/mLⅠ型胶原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到胶原纤维；将0.05-0.15mg/mL探针溶液加入到胶原纤维分散液中，在4℃孵育3hrs，离心后弃上清液，然后加入1×PBS振荡，离心后弃上清液，重复三次，用以洗掉未结合探针，然后将处理后的胶原纤维分散液滴于载玻片上，使用荧光显微镜获取图像。