[发明专利]一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌及其应用

说明书

本发明公开一株高效生产2，3，5，6‑四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌。该工程菌是携带阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的大肠杆菌。利用本发明的基因工程菌转化葡萄糖生产2，3，5，6‑四甲基吡嗪，最高产量达16.40g/L，产物纯度≥98％，且具有反应条件温和、副产物少和产物易于分离纯化的优势，具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一株用于生产2，3，5，6-四甲基吡嗪的大肠杆菌基因工程菌及其应用。

背景技术

2，3，5，6-四甲基吡嗪(2，3，5，6-Tetramethylpyrazine，TMP)是有效治疗心脑血管疾病的药物。由于显著的疗效，TMP深受医患的推崇，成为目前临床最为常用的药物之一，需求巨大，因而TMP的合成研究获得广泛关注。目前，TMP的合成方法主要是化学法，包括气相催化法、α-氨基酮缩合法、邻二胺和邻二酮缩合法以及氮代邻二酮或者α-叠氮基酮缩合法(臧传近，等.山东化工.2015，44(18)：23-25)。然而，上述化学合成法均具有反应条件要求高和副产物较多的不利因素。鉴于我国“十三五”发展规划中大力提倡的绿色和可持续发展的理念，迫切需要探索TMP的新型绿色合成工艺。

与化学合成方法相比，生物合成方法具有反应条件温和、副产物少和转化率高等优点。利用生物法替代化学法生产TMP已有文献报道。例如，Zhu等利用B.subtilis野生型菌种生产TMP，摇瓶产量达到7.46g/L，发酵罐产量达到7.34g/L(Zhu BF and Xu Y.BioprocBiosyst Eng.2010，33(8)：953-959)。Xiao等利用B.subtilis生产的TMP产量达到8.34g/L，是利用野生型菌株合成TMP的最高值(Xiao Z，et al.Biotechnol Biofuels.2014， 7(7)：106-113)。上述研究利用微生物生产TMP的前体物质乙偶姻，然后添加铵盐，经简单的化学热力学过程合成TMP(图1)，该过程反应速率快，副产物少，具有工业化生产的潜质(Xiao Z，et al.Biotechnol Biofuels.2014，7(1)：1)。同时，该方法反应条件温和，纯化成本低廉。然而上述研究虽然成功实现了TMP的微生物法合成，但是产量和生产速率尚无法满足工业生产的需求，原因在于TMP的合成前体乙偶姻的浓度较低，是相关行业亟待解决的瓶颈问题之一。

研究表明，通过协同表达α-乙酰乳酸合成酶AlsS、α-乙酰乳酸脱羧酶AlsD和NADH氧化酶NOX，是解决乙偶姻产量低，实现工程菌高效合成TMP的有效途径。基因协同表达的关键，在于基因表达强度的精细调控，以使不同基因在宿主菌株代谢网络中处于合适的表达强度，有效行使催化功能。研究发现，通过改变启动子下游核糖体结合位点到基因起始密码子之间的碱基个数，以及改变核糖体结合位点的碱基，可以影响基因的翻译效率，实现基因表达的精细调控(Vellanoweth RL and Rabinowitz JC.Mol Microbiol.1992，6(9)：1105-1114)。

发明内容

针对现有技术TMP产量不足，难以工业化生产的现状，本发明要解决的问题是构建一株乙偶姻高产的大肠杆菌工程菌株，同时建立乙偶姻高效转化生产TMP的工艺，以应用该工程菌发酵葡萄糖高效生产TMP。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所述大肠杆菌工程菌，含有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD，序列如SEQ ID 2所示，以及短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH 氧化酶基因nox，序列如SEQ ID 3所示。

上述乙偶姻合成操纵子alsRSD，含有alsR(编码乙偶姻合成调控因子)、Pabc(乙偶姻合成启动子)、alsS(α-乙酰乳酸合成酶)和alsD(α-乙酰乳酸脱羧酶)，序列长度3460个碱基。