[发明专利]一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌及其应用

权利要求书

1.一株用于生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述基因工程菌含有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)来源乙偶姻合成操纵子alsRSD，序列如SEQ IDNO.2所示；并优化短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的表达，基因nox序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其中优化短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源NADH氧化酶基因nox的表达，是通过选取P_tac启动子、强核糖体结合位点TAAGGAGG，并优化核糖体结合位点到基因nox起始密码子之间的距离为3-11个碱基实现的。

3.权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖生产2,3,5,6-四甲基吡嗪的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养方法如下：在无菌条件下，将过夜培养活化的所述大肠杆菌工程菌菌液以体积比1％-10％的接种量接种发酵培养基，在培养基pH值5.0-9.0，培养温度37±1℃，搅拌转速200-500rpm，无菌空气通入量0.5vvm-2.0vvm条件下发酵培养48-96小时；在培养过程中，待培养基中葡萄糖浓度降至20g/L以下，补加无菌的600-800g/L葡萄糖溶液，至培养基葡萄糖浓度为40-60g/L，当测定发酵液中乙偶姻浓度不再增加时，停止发酵；将发酵液离心，上清液加入(NH₄)₂HPO₄至溶液中NH4⁺与乙偶姻的浓度比为1:1-3:1，在60℃-100℃条件下水浴0.5-2小时，然后冰浴0.5-2小时，离心，弃上清液，沉淀用冰水洗涤2次，获得2,3,5,6-四甲基吡嗪晶体，

其中，上述发酵培养基的配方为：1L蒸馏水中含有80g葡萄糖，10g酵母粉，3.0gCH₃COONa·3H₂O，0.60g KH₂PO₄，0.40g MgSO₄，0.10g MnSO₄，0.060g FeSO₄。