[发明专利]微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种抑制胃癌血管生成的方法。

背景技术

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，最新流行病学调查表明胃癌在中国的发病率位居第二，死亡率位居第四。与多数恶性肿瘤相同，胃癌的多种生物学行为不仅与癌细胞自身特征有关，还与其微环境息息相关，特别是需要不断地形成新生血管以实现其所需营养物质的供应。因此，若能阻断肿瘤血管生成的过程，则有可能在一定程度上抑制肿瘤的生长、侵袭与转移。目前已经发现的与肿瘤血管生成相关的因子有很多，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用最为显著。VEGF作用于其受体VEGFR，调节血管内皮细胞与基底膜间的相互作用，从而促进血管新生。研究显示，对于行根治性手术的中早期胃癌患者，高水平的VEGF与肿瘤不良特征和总生存差密切相关；而对于接受化疗的晚期胃癌患者，VEGF高表达者生存期较短、预后较差。

现阶段针对VEGF抗血管生成的靶向药物——贝伐单抗在胃癌患者中进行的临床试验——AVAGAST试验显示，贝伐单抗联合化疗用于晚期胃癌的一线治疗并未显著延长生存期，回顾分析其失败原因可能与病例选择、群体遗传学或肿瘤生物学方面的地区差异有关，事先筛选恰当的标记物可能会改善试验的有效率。而由于转录翻译是个受多因素调控的复杂过程，基因水平的扩增或突变并不能全部体现为蛋白水平的异常表达。因此基于单抗的治疗原理，靶向针对蛋白水平的VEGF，即使筛选出一定程度上相关的标记物，也只覆盖了小部分VEGF在基因已发生扩增的群体。此外，单抗的制备过程成本高，耗时长，平均约3-6个月，患者的经济负担沉重；且贝伐单抗由中国仓鼠卵巢细胞表达系统产生，种间免疫反应较种内更为复杂。

发明内容

目的是克服以上技术缺陷，采用高效、廉价、人源，同时实现转录后调控，避免因转录后与翻译过程出现基因沉默而缩小人群覆盖范围，影响疾病的诊断与治疗。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种抑制胃癌血管生成的方法，即以微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，具体包括微囊泡的提取、电子显微镜下观察微囊泡的状态、miRNA定量分析、蛋白提取及Western blot、ELISA、EdU增殖实验、体外血管生成实验和成瘤实验以及尾静脉注射微囊泡实验。

(1)微囊泡的提取

人胚肾细胞HEK293T未经处理或经转染miR-29a/c mimics/inhibitor、NC mimics/inhibitor后24-48小时，收集细胞培养液；室温下3000转/分，离心20分钟后，4℃10,000g离心30分钟，目的是为了去除细胞及细胞碎片；离心后取上清液，4℃110,000g超速离心60分钟；后弃净上清液，用适量的1×PBS重悬沉淀后，再次4℃110,000g超速离心60分钟；弃净上清液，用适量的1×PBS重悬沉淀后于-80℃保存备用，或直接加入待孵育细胞中或进行小鼠尾静脉注射实验。

(2)电子显微镜下观察微囊泡的形态

将超速离心得到的微囊泡立即转移到离心管后加入2.5％的戊二醛固定20分钟；1×PBS清洗3次，每次10分钟；1％锇酸4℃冰箱固定1分钟；经梯度丙酮脱水之后，将丙酮与Eponate12按1:1配制浸透液，然后将脱水后的微囊泡置于浸透液中浸透4小时；后将微囊泡用环氧树脂Eponate12进行包埋，置于60℃烤箱中12小时；经切片后，用铅铀常规染色后，在电子显微镜下观察，记录电镜下微囊泡的形态。

(3)miRNA定量分析

miRNA采用TaqMan荧光探针法：按16℃15min、42℃1h、85℃5min进行逆转录，95℃5min，95℃15s、60℃1min 40个循环进行RT-qPCR，定量分析miR-29a/c水平。

(4)蛋白提取及Western blot

使用裂解液(1.1X SDS lysis buffer，含蛋白酶抑制剂)于冰上提取蛋白，恒压100V电泳，恒流250mA冰浴中转膜3h，2％BSA封闭1h，后4℃摇床分别孵育一抗Anti-ERBB3、Anti-GAPDH过夜，次日TBST洗膜后分别孵育二抗羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 1h，再次TBST洗膜后，曝光，并用ImageJ进行灰度分析。

(5)ELISA