[发明专利]微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法

权利要求书

1.微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，包括微囊泡的提取、电子显微镜下观察微囊泡的状态、miRNA定量分析、蛋白提取及Western blot、ELISA、EdU增殖实验、体外血管生成实验和成瘤实验以及尾静脉注射微囊泡实验。

2.根据权利1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述微囊泡的提取方法如下：

步骤(1)：人胚肾细胞HEK293T未经处理或经转染miR-29a/c mimics/inhibitor、NC mimics/inhibitor后24-48小时，收集细胞培养液；

步骤(2)：将步骤(1)的培养液在室温下，放入离心机，以3000转/分的速度，离心20分钟后，4℃、10000g离心30分钟后，去除细胞及细胞碎片，离心后取上清液，4℃、110000g超速离心60分钟超速离心60分钟；后弃净上清液，用适量的1×PBS重悬沉淀后，再次4℃110,000g超速离心60分钟；弃净上清液，得到微囊泡。

3.根据权利要求1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述电子显微镜下观察微囊泡的状态的方法如下：将步骤(2)得到的微囊泡立即转移到离心管后加入2.5％的戊二醛固定20分钟；1×PBS清洗3次，每次10分钟；1％锇酸4℃冰箱固定1分钟；经梯度丙酮脱水之后，将丙酮与Eponate12按1:1配制浸透液，然后将脱水后的微囊泡置于浸透液中浸透4小时；后将微囊泡用环氧树脂Eponate12进行包埋，置于60℃烤箱中12小时；经切片后，用铅铀常规染色后，在电子显微镜下观察，记录电镜下微囊泡的形态。

4.根据权利要求1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，将步骤(2)得到的微囊泡采用TaqMan荧光探针法进行miRNA定量分析，按16℃15min、42℃1h、85℃5min进行逆转录，95℃5min、95℃15s、60℃1min 40个循环进行RT-qPCR，定量分析miR-29a/c水平。

5.根据权利要求1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述蛋白提取及Western blot的步骤如下:使用裂解液于冰上提取蛋白，恒压100V电泳，恒流250mA冰浴中转膜3h，2％BSA封闭1h，后4℃摇床分别孵育一抗Anti-ERBB3、Anti-GAPDH过夜，次日TBST洗膜后分别孵育二抗羊抗鼠 IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 1h，再次TBST洗膜后，曝光，并用ImageJ进行灰度分析。

6.根据权利要求1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述ELISA的步骤如下，细胞经转染后24-48小时，收集培液，低速离心后取上清分装，-20℃保存备用；稀释标准品至5000pg/ml，室温静置10分钟，后倍比稀释至2500、1250、625、312.5、156、78pg/ml；向96孔板每孔中加入100μl上述各个浓度稀释的标准品和细胞上清液，37℃孵育1.5小时后，弃净孔内液体；稀释检测液A100倍，每孔加100μl，37℃孵育1小时后，弃净孔内液体；清洗后稀释检测液B 100倍，每孔加100μl，37℃1小时，弃净孔内液体；清洗后每孔加入90μl底物溶液，37℃避光孵育显色30分钟；每孔加50μl终止液终止反应(蓝色变成黄色)；用酶标仪测定每个孔在波长450nm的吸光度值，即OD值；根据标准品的OD值，对每种处理的细胞培养液中的VEGF的蛋白浓度进行定量分析。

7.根据权利要求1所述的微囊泡作为miRNA运输载体抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述EdU增殖实验的步骤如下，铺24孔板，次日转染，24h后按1000:1稀释EdU试剂A，500μl/孔加至24孔板，4-6h后经PBS清洗，后按说明书步骤完成操作，于荧光显微镜下在RFP及DAPI通道分别采集图像，并进行merge及统计分析。