[发明专利]一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于适配体识别和过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法。利用溶剂热法制备得到具有过氧化物酶活性的铁酸锌/还原氧化石墨烯纳米模拟酶，通过以固定于微孔板的适配体1为捕获探针，以适配体2修饰的铁酸锌/还原氧化石墨烯为过氧化物模拟酶，当体系中存在沙门氏菌时，适配体与沙门氏菌发生特异性结合，从而形成(微孔板)适配体1‑沙门氏菌‑适配体2/铁酸锌/还原氧化石墨烯的三明治夹心结构，加入显色底物TMB(3,3',5,5'‑四甲基联苯胺)‑H₂O₂，铁酸锌/还原氧化石墨烯过氧化物模拟酶可催化H₂O₂氧化TMB发生显色反应，从而实现对牛奶中沙门氏菌的检测。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，属于食品安全检测领域。

背景技术

沙门氏菌是一种肠道杆菌致病菌，在自然界中广泛存在，特别容易污染水源、食品及畜产品。食用了感染沙门氏菌的食物会引发突发性食物中毒，出现伤寒、急性肠胃炎、菌血症和败血症等症状，对于人类和动物的健康均构成极大危害。各国政府机构普遍提出该致病菌的限量要求，我国规定在乳制品、肉制品、水产制品、即食蛋制品等11类食品中沙门氏菌不得被检出。因此建立一种快速、准确、便捷的沙门氏菌检测方法，对于保障食品安全具有重要意义。

传统的沙门氏菌检测方法主要包括传统的平板计数法、分子生物学法、免疫学方法等。平板计数法因其检验程序较繁琐，耗时长，难以满足现场快速检测的需要。分子生物学技术，虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分析法具有特异性强、灵敏度高、易于肉眼观察等优点，可应用于现场快速检测。然而其识别分子-抗体，制备成本高，周期长，且稳定性不佳；其信号分子-辣根过氧化酶(HRP)，属天然酶，活性高但稳定性欠佳，易受环境因素的影响，从而限制了酶联免疫检测的发展。

发明内容

本发明目的在于克服上述不足之处，以适配体作为识别分子，以纳米模拟酶催化底物显色，将适配体和纳米生物技术及可视化检测等诸多技术的优势强强联合，建立一种简单快捷而又具有极高灵敏度和特异性的沙门氏菌检测方法。

本发明的技术方案，一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，将生物素化适配体固定于包被有亲和素的微孔板中作为捕获探针，同时制备铁酸锌/还原氧化石墨烯过氧化物模拟酶，并将另一条沙门氏菌的适配体固定于铁酸锌/还原氧化石墨烯表面作为信号探针，当加入沙门氏菌时，捕获探针和信号探针中的适配体均与沙门氏菌发生特异性结合，形成(微孔板)适配体-沙门氏菌-适配体/铁酸锌/还原氧化石墨烯的三明治夹心结构，最后加入显色底物TMB-H₂O₂，铁酸锌/还原氧化石墨烯复合纳米材料可以作为过氧化物模拟酶，催化H₂O₂氧化TMB发生显色反应，从而实现对食品中沙门氏菌的检测。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

实现本发明的具体方法：

一种适配体过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

1)捕获探针的制备：100μL，20(μg/mL)的亲和素于微孔板中4℃包被过夜；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；接着加入200μL生物素化的适配体1(200nM)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μL 1％的BSA于37℃孵育1h封闭孔板；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min，以防后续实验步骤中产生非特异性吸附。

2)信号探针的制备：