[发明专利]人JAK2V617F基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人JAK2V617F基因突变检测试剂盒。

背景技术

真性红细胞增多症(PV)是一种造血干细胞克隆性疾病，临床以红细胞数及容量显著增多为特点，出现多血质及高黏滞血症所致的表现，常伴脾大。PV起病隐袭，进展缓慢，晚期可发生各种转化。本病在人群中的发病率约为2.8/10万，较常见于男性(大约是1.4∶1)，诊断时的平均年龄是60岁，范围为15到90岁，但儿童罕见，5％的病人发病时不足40岁。

真性红细胞增多症属骨髓增殖性疾病范畴，为典型骨髓增殖性肿瘤中的一种。骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms，MPNs)是指骨髓组织持续增殖而引起的一组疾病，常表现为造血干细胞的一系或多系细胞恶性增生。根据增生的细胞系的不同，MPNs又可分为典型MPNs和非典型MPNs。典型MPNs包括真性红细胞增多症(Polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(Essential thrombocythemia，ET)、原发性骨髓纤维化(Primary myelofibrosis，PMF)和慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)，它们之间关系密切，具有相似的临床特征并常可相互转化或合并存在。

早在上个世纪60年代，CML的发病机制就已经明确，即CML患者体内存在费城染色体，因此CML又称费城染色体阳性MPNs。目前，国内外各大医院也正是通过检测患者是否存在费城染色体进行CML的诊断。直到2005年4月，科学家们在费城染色体阴性MPNs发病机理的研究方面取得了实质性的突破。研究结果表明：近97％的PV患者、约50％的ET患者和50％左右的PMF患者存在JAK2V617F的突变，随后的JAK2V617F转基因小鼠模型和骨髓移植小鼠模型证明了JAK2V617F突变是导致MPNs的主要原因，揭示了MPNs发病的分子机制。

目前，对于MPNs的诊断，国内绝大多数医院仍采用常规的诊断方法，即根据主要诊断指标(红细胞容量、动脉血氧饱和度、脾脏肿大情况等)再结合次要诊断指标(白细胞增多、中性粒细胞碱性磷酸酶活性、血清VB12含量等)进行诊断，诊断项目繁多，费用较高。而且传统的诊断方法经常不能确诊和导致误诊，延误了患者的治疗，给患者本人及其家属带来了极大的痛苦和负担。由于通过检测JAK2V617F来确诊MPNs具有充分的科学依据，在2008年，世界卫生组织(WHO)已经将检测JAK2V617F作为PV、ET和PMF的一项主要的诊断指标。

综上所述，本发明拟提供一种检测人JAK2V617F基因突变的试剂盒，使MPNs疾病，尤其是PV疾病的诊断更加准确、便捷和快速。

发明内容

本发明提供的检测人JAK2V617F基因突变的试剂盒将基因的提取和突变检测有机整合至一个试剂盒中，简化了实验的操作步骤，提高了实验的效率。

本发明采取的技术方案如下：

人JAK2V617F基因突变检测试剂盒，包括A盒和B盒，A盒包括磁珠BC、裂解液BL、洗涤液BW1和洗脱液CE；B盒包括预混液I、预混液II、阳性标准品、阴性标准品、超纯水、15mg/mL的蛋白酶K溶液、DNALoading Buffer和DNA Marker。

优选的，所述预混液I制备步骤包括：将20μM的JAK3引物(SEQ ID NO.2所示)和20μM的JAK4引物(SEQ ID NO.3所示)等体积混合，然后将混合引物与2×Taq PCR MIX Loading Dye-free按体积比2∶55的比例混匀即得。

优选的，所述预混液II制备步骤包括：按照终浓度为5μM J2f引物(SEQ ID NO.4所示)、5μM J2r引物(SEQ ID NO.5所示)、10μM J2nf引物(SEQ ID NO.6所示)和40μM J2mr引物(SEQ ID NO.1所示)的量配制巢式PCR引物，然后将巢式PCR引物与2×Taq PCR MIX Loading Dye-free按体积比2∶55的比例配制，混匀即得。

优选的，所述蛋白酶K溶液为将蛋白酶K溶解于Tris-HCl、CaCl₂和甘油三者的混合溶液中获得；所述Tris-HCl浓度为10mM，pH值7.5，CaCl₂浓度为20mM，甘油质量分数为50％。