[发明专利]一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于循环肿瘤细胞检测的微流体系统，具体为一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的基于硅纳米线基底的微流体系统。

背景技术

随着污染程度的增加，肿瘤的患病几率已经高于1/3的比例。对于肿瘤的诊断方法主要包括：病理学(活检切片)；影像学(超声、X光、CT或PET等)和血清学(血清肿瘤相关蛋白，如CA-125、CA-199或CEA等)。然而这些方法对存在自身的缺陷，不能为不断变化肿瘤和诊断预警提供帮助。目前临床公认的人外周血循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，简称CTC)检测目前已被公认为最好检测手段之一。

在2004年，美国药品与食品监督管理局首次批准通过了第一个有关CTC富集和计数的技术产品。这一产品是利用细胞表面所表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)与干细胞因子受体(cKit)来完成细胞的分选的。EpCAM在绝大多数的上皮细胞上多有表达，因此在来源于上皮细胞的肿瘤细胞中也有表达。c-Kit是典型的Ⅲ型受体酪氨酸激酶,在肿瘤的发生发展以及侵袭、迁移和复发过程中起着十分重要的作用,是目前肿瘤分子靶向治疗的热门靶标之一。修饰有anti-EpCAM或anti-cKit的磁珠与固化的血液细胞相互作用，这样一来所有表达EpCAM或cKit的细胞表面都会附着一些磁珠，最后再通过磁场进行分选。要进一步识别双阳性CTC,所有被捕获的细胞会首先从磁珠上解离下来，然后用细胞角蛋白Krt19以及白细胞抗原(CD45)的荧光抗体进行标记。在这一系统中，对于CTC的技术定义是EpCAM+/cKit+/CD45-有细胞核的物体。该设备和方法已被作为一个嵌入式生物标志物应用在几个治疗相关的临床试验中。首个有关CTC计数检测的大规模临床试验是于2004年进行的，主要针对已经发生转移的乳腺癌病人。这次试验所得出的治疗前和治疗期间的CTC检测结果同时预测了无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。很短的时间内，在多种不同的癌症研究中也进行了类似的CTC计数测试，其中就包括肠癌、皮肤癌、肺癌和前列腺癌，并且得出了类似的发现。值得注意的是，这些研究大多将CTC计数检测结果分为两类：定性的作为(对于评价病人病情)有利或者不利，而不是把他们作为一个可连续变化的定量数据。

目前CTC技术的局限性所带来的各种问题。首先，在CTC研究中检测灵敏度还是至关重要的影响因素。FDA批准通过的CTC技术在50％的食管鳞状细胞癌病人中都无法检测出CTC。其次，基于EpCAM单独抗体的CTC富集技术会无法检测出正在发生上皮间质化转化的肿瘤细胞。早期的CTC研究已经证明有些病人的CTC具有间质化特征，所以通常认为上皮间质化现象在CTC的产生过程中起着非常重要的作用。第三，仅仅对CTC进行计数，忽视了CTC中亚群的重要意义。在最近的研究中显示，一些CTC所具有的特异形貌特征和剪接变异体的表达与肿瘤内脏转移和癌症抗药性有关联。这些发现都指出CTC作为肿瘤标志物，不仅仅用来做计数。第四，将血液样品先固定化再进行检测的方法会限制分离CTC后下游的分子分析研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现CTC检测时纯度和灵敏度不够高，同时捕获的CTC不能继续用于后序研究的缺陷，提供一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的基于硅纳米线基底的微流体系统。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统，采用以下步骤制备：

一、PDMS微流体芯片的制作

PDMS微流体管道系统包括一个入口和一个出口，从入口处分为2条以上平行的微流体信道，微流体信道内设置有若干个鱼骨结构；优选的鱼骨结构为由PDMS打印成的若干个V形槽，单个鱼骨结构内V形槽相互平行，相邻的鱼骨结构的V形槽的顶角上下交错；在入口和出口处均设置有PDMS孔洞；

优选的所述PDMS微流体管道系统从入口处分为2条平行的微流体信道，各信道长为25mm，宽位2mm；所述微流体信道内鱼骨结构的宽为50微米，间距50微米，高30微米。这种鱼骨结构增加了细胞捕捉效率，而且可以在流道内产生明显的涡流，可以批量低成本生产。

优选的，所述PDMS微流体管道的各分流处设置有圆角，一方面增加样本导流，另一方面减低细胞因剪切力造成的伤害。在进入信道0.5mm处才开始产生由鱼骨结构产生的涡流效应，鱼骨结构对细胞溶液搅动，增加细胞接触硅纳米线的机会；