[发明专利]一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统及其应用

权利要求书

1.一种检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，采用以下步骤制备：

一、PDMS微流体芯片的制作

PDMS微流体管道系统包括一个入口和一个出口，从入口处分为2条以上平行的微流体信道，微流体信道内设置有若干个鱼骨结构，在入口和出口处均设置有PDMS孔洞；

二、硅纳米线基底的刻蚀

1)、在硅片上旋转涂覆SU-8光阻胶，通过标准光刻方法限定刻蚀区域，仅刻蚀平行的微流体信道需要覆盖的区域；

2)、通过NH4F/AgNO3试剂引入Ag纳米颗粒沉积，在硅片表面形成钠米粒子膜；

3)、采用H₂O₂/NH4F进行刻蚀，得到与平行的微流体信道相对应的钠米线；

4)、先采用浓硝酸洗去Ag纳米颗粒，然后采用浓硫酸/双氧水混合溶液清洗硅片表面，然后去离子水洗涤干净；浓硫酸/双氧水的体积比为3:1；

三、硅纳米线的表面修饰和生物功能化

1)、用无水乙醇清洗硅纳米线基底，超净环境下N2气吹干；

2)、新鲜制备的质量浓度为1.0％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并将清洗干燥后的具有硅纳米线的硅片浸泡在其中半小时；

3)、取出表面键合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅片，用工业级乙醇清洗，N2气吹干；

4)、将硅片在新鲜制备的50ng/mL的聚乙二醇2-氨基乙基醚生物素PBS溶液中静置3小时，以工业级乙醇清洗，N2气吹干后保存在4℃干燥环境下备用；

5)、在样品测试前，用PBS清洗芯片表面两次后，加入200μL的5.0μM链霉亲和素溶液，37℃孵育1小时；PBS清洗后，再和含有生物素修饰的p-EpCAM和p-cKit两种多肽的200μL PBS溶液共孵育1小时，以PBS清洗后用于CTC的捕获；

四、硅纳米线基底的修饰和PDMS微流体芯片的组装

1)、制备5.0μM的链霉亲和素PBS溶液200μL，覆盖在PDMS微流体芯片上，于37℃静置1小时，PBS清洗三遍；PBS清洗后，再和含有生物素修饰的p-EpCAM和p-cKit两种多肽的200μL PBS溶液共孵育1小时，以PBS清洗后用于CTC的捕获；

2)、再将硅纳米线基底的芯片放置到芯片载台上，并将平行的微流体信道与钠米线相对应，再以载台的上盖压住微流体芯片；

3)、将入口和出口处的PDMS孔洞连接分别连接Tygon流体输送管，并和已经安装在注射泵上的注射器链接。

2.如权利要求1所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，所述的鱼骨结构为由PDMS打印成的若干个V形槽，单个鱼骨结构内V形槽相互平行，相邻的鱼骨结构的V形槽的顶角上下交错。

3.如权利要求2所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，硅纳米线基底的刻蚀时选用厚度为0.7毫米、长为50毫米和宽为25毫米的硅片，钠米线长度为2～5微米。

4.如权利要求1所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，硅纳米线基底的刻蚀时步骤2)中Ag纳米颗粒沉积小于等于50nm。

5.如权利要求3所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，所述PDMS微流体管道系统从入口处分为2条平行的微流体信道，各信道长为25mm，宽位2mm；所述微流体信道内鱼骨结构的宽为50微米，间距50微米，高30微米。

6.如权利要求1所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统,其特征在于，所述PDMS微流体管道的各分流处设置有圆角。

7.如权利要求1-6任一项所述的检测食管鳞状细胞癌循环肿瘤细胞的微流体系统的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将待测样本细胞与含有生物素修饰的p-EpCAM和p-cKit两种多肽的200μL PBS溶液共孵育1小时，之后以1000rpm的离心方式分离出有生物素修饰p-EpCAM和p-cKit两种多肽特异性吸附的细胞进行检测；

2)、将细胞待测样本通过注射器注射进入微流体系统内进行检测。