[发明专利]一种基因合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因合成领域，具体涉及一种基因合成方法。

背景技术

目前基因合成技术普遍利用DNA聚合酶，在体外模拟DNA复制，彼此带有 同源序列的引物在DNA聚合酶的作用下能彼此延伸得到目的DNA片段，最终将 得到的DNA片段分离纯化后克隆到指定载体中测序验证，这一技术我们称之为 基于PCR的基因合成技术。该技术原理简单、易用，但操作过程十分复杂，整个 过程需要经历PCR体系的配制、上机扩增、电泳检测回收、酶切连接、转化等繁 琐的实验操作步骤；同时PCR过程会将引物本身带有的突变放大导致合成出错； 并且高度重复序列、高GC、高AT、反向重复、回文等高级结构因PCR不能正常 扩增而导致合成的失败，成为基于PCR的基因合成技术的一大难点和瓶颈。与之 对应的是大量的人力，物力和时间的耗费，因此极大了限制了合成的通量和人均 产能。随着基因研究的不断深入，目前“读基因”(基因测序)拥有全自动的高通 量测序仪，但“写基因”(基因合成)全都依赖人工合成，因此繁琐的实验步骤、 目前技术手段的内在短板成为了写基因的限速步骤。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种基因合成方 法，不依赖PCR扩增，规避了PCR扩增中繁琐的实验步骤；同时规避了PCR技 术错误率高，难以扩增高度重复、高GC、高AT含量、发卡结构等难度序列的缺 陷；本发明能将具有相同或不同来源的基因同步组合合成，构建基因突变库，具 有灵活性。

为了解决上述缺陷，本发明采用如下技术方案：一种基因合成方法，所述方 法包括：

(1)将待合成基因序列分成55-100bp长度的第一连续片段，将所述第一连 续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15-20bp长度处的基因序列 作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引 物；

(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)将所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；

(4)将合成的双链DNA片段连接到pUC57-GFP-Amp载体上，所述载体的 序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。

作为进一步的优选，所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接 头序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接头序列。

作为进一步的优选，所述接头序列包括载体序列的粘性末端序列和含金门克 隆反应的接头序列。

作为进一步的优选，所述正向引物和反向引物完全覆盖基因的正向序列和反 向互补序列，并在所述引物混合物煮沸退火时在上一引物和下一引物之间配对形 成约15-20bp长度的双链。

作为进一步的优选，所述步骤(1)中，根据待合成基因的长度大小，进行 基因分组，每组长度为700-800bp，再将700-800bp长度的基因序列分成长度 55-100bp连续片段。

作为进一步的优选，所述步骤(3)中，将所述引物混合物经T4多聚核苷酸 激酶磷酸化处理后煮沸、退火，再由T4 DNA连接酶处理，将引物连成两端带长 粘性末端的双链DNA片段。

作为进一步的优选，所述待合成基因序列的长度为500-800bp。

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，所述pUC57-GFP-Amp载体的制备方 法包括：提供一pUC57载体，将所述pUC57载体改造获得含GFP基因、无SapI 酶切位点的pUC57-SapI free-Amp载体，通过双酶切和T4 DNA外切酶活性得到线 性化的两端为长粘性末端的载体。

作为进一步的优选，所述步骤(4)中，将合成的双链DNA基因连接到所述 pUC57-GFP-Amp载体上，包括：通过同源重组的方法将含粘性末端的基因连接到 含有对应长粘性末端的载体上，通过GFP荧光进行反向筛选转化该质粒的大肠杆 菌。

作为进一步的优选，还包括：将克隆到所述载体的基因片段质粒通过1到3 轮金门克隆反应进行拼接，得到全长基因。