[发明专利]一种基因合成方法

权利要求书

1.一种基因合成方法，其特征在于：所述方法包括：

(1)将待合成基因序列分成55-100bp长度的第一连续片段，将所述第一连续片段设计成正向引物；将与所述第一连续片段错开15-20bp长度处的基因序列作为第二连续片段，在所述第二连续片段的反向互补序列上设计连续的反向引物；

(2)将所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)将所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多个缺刻的双链DNA片段；

(4)将合成的双链DNA片段连接到pUC57-GFP-Amp载体上，所述载体的序列如序列表1所示，转化大肠杆菌细胞，反向筛选不发荧光的菌落，测序验证。

2.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接头序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接头序列。

3.根据权利要求2所述的基因合成方法，其特征在于：所述接头序列包括载体序列的粘性末端序列和含金门克隆反应的接头序列。

4.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物和反向引物覆盖基因的正向序列和反向互补序列，在所述引物混合物煮沸退火时，上一引物和下一引物之间配对形成15-20bp长度的双链。

5.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中，根据待合成基因的长度大小，进行基因分组，每组长度为700-800bp，再将700-800bp长度的基因序列分成长度55-100bp连续片段。

6.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将所述引物混合物经T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理后煮沸、退火，再由T4DNA连接酶处理，将引物连成两端带长粘性末端的双链DNA片段。

7.根据权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述待合成基因序列的长度为500-800bp。

8.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述pUC57-GFP-Amp载体的制备方法包括：提供一pUC57载体，将所述pUC57载体改造获得含GFP基因、无SapI酶切位点的pUC57-SapI free-Amp载体，通过双酶切和T4DNA外切酶活性得到线性化的两端为长粘性末端的载体。

9.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将合成的双链DNA基因连接到所述pUC57-GFP-Amp载体上，包括：通过同源重组的方法将含粘性末端的基因连接到含有对应长粘性末端的载体上，通过GFP荧光进行反向筛选转化该质粒的大肠杆菌。

10.根据权利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述方法还包括：将克隆到所述载体的基因片段质粒通过1到3轮金门克隆反应进行拼接，得到全长基因。