[发明专利]一种乳杆菌VBNC态的诱导方法

说明书

本发明涉及一种乳杆菌VBNC态的诱导及其检测方法，该方法包括乳杆菌的活化、乳杆菌VBNC态的诱导、乳杆菌VBNC态的检测、荧光显微镜检测样品前处理与荧光显微镜检测等步骤。本发明使干酪乳杆菌Zhang通过灭菌生理盐水4℃诱导成功获得了的该菌的VBNC态，保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导下进入VBNC态，且乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，依旧保持完整细胞结构。所述的乳杆菌VBNC态仍具有一定的活性，并在适当条件下会恢复至可培养态，为提高乳杆菌在生产应用过程中活性的研究奠定基础。同时，本发明采用荧光染料(SYTO‑9和PI)与Leica DM4000B正置荧光显微镜的结合建立了一种采用载玻片而非滤膜的方便、快速检测细胞活性的方法。

【技术领域】

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种乳杆菌的VBNC态诱导方法。

【背景技术】

目前，人们认为细菌通常有“活的可培养态”、“活的不可培养态”和“死亡态”三种状态，活性细菌应该指的是前两种。早在上世纪80年代初，徐怀恕等人(Survival andviability ofnonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in theestuarine and marine environment.)就首次提出活的不可培养态(Viable butnonculturable,VBNC)细菌的概念。这种活的不可培养态细菌在不良外界条件下会处于异常的生理状态，在常规培养基上不能生长繁殖，但细菌在这种状态下依然保持低水平代谢活性和一定的基因表达。当恶劣环境解除时，它又会回到可培养状态，所以VBNC态细菌也是有一定活性的。截止到2016年3月，已经发现了42个属的68种细菌存在VBNC态，但其中大部分为为革兰氏阴性致病菌，对革兰氏阳性菌的研究并不多见。检测某细菌是否具有VBNC态与细菌种类、诱导条件和检测方法等有关。

乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不产生芽孢、发酵糖类物质产生以乳酸为主要代谢产物的细菌总称。乳酸菌种类繁多，分布也极其广泛，目前已发现乳酸菌包括43个属，373个种和亚种，而且每年都有新乳酸菌种属被分离和发现(http://www.bacteria.cict.fr/)。乳酸菌根据形态可分为杆菌和球菌；根据生化特性主要分为乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等。乳杆菌是乳酸菌的一个属。

在研究我国少数民族地区自然发酵乳制品中乳酸菌多样性时，本发明人发现通过DGGE、焦磷酸测序等非培养技术方法检测到在平板培养法难以分离得到的乳酸菌种属，这证实了在传统发酵乳制品中确实存在着VBNC态的乳酸菌。有些乳酸菌是人和动物的肠道益生菌，它具有改善机体代谢，促进生长和提高免疫力等优点，并对维持肠道的生态平衡有重要作用。但乳酸菌在进入胃肠道系统时要面临胃酸和胆盐等不利自身生存的环境，可能会导致其进入VBNC态，这样不但影响了其自身的生长和代谢，还可能会直接影响其应用过程中益生功能的发挥。此外，在乳酸菌发酵剂的制备、生产和应用过程中不可避免的要耐受各种环境压力，诸如极端的温度、酸、高温、低温、冷、渗透压、氧和饥饿等，导致其可能进入VBNC态。

采用传统平板计数法不能对VBNC态细胞进行计数，随着荧光染料与显微镜结合法、RT-PCR法、流式细胞仪检测法等非培养技术的出现，使我们能有更好地去研究活性细胞，特别是VBNC态细胞。荧光显微镜观察法是研究VBNC态细菌最常见的方法，由于这种方法操作简单方便、节省时间，所以被广泛于细菌活性的检测。细菌活性检测常用的荧光染料包括吖啶橙、SYTO-9、PI(碘化丙啶)、萘啶酮酸、溴化乙啶等。SYTO-9是一种能穿透完整细胞膜的小分子核酸荧光染料，PI是一种能渗透到细胞膜破损细胞内的大分子核酸染料。细胞染色后在荧光显微镜下观察时，有完整质膜结构的活性细胞呈绿色，细胞膜结构被损坏的死细胞呈红色。