[发明专利]一种乳杆菌VBNC态的诱导方法

权利要求书

1.一种乳杆菌VBNC态的诱导方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A.乳杆菌的活化

将冷冻保存的乳杆菌接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养，传代培养三代，得到活化乳杆菌，离心分离，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；所述的乳杆菌是干酪乳杆菌Zhang；该乳杆菌的活化是在温度37℃下活化培养18～24小时；

B.乳杆菌VBNC态的诱导

将步骤A得到的乳杆菌菌悬液接入到灭菌生理盐水诱导液体中，使乳杆菌终浓度10⁶～10⁷CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后在4℃的温度下对诱导液中乳杆菌进行VBNC态诱导；

C.乳杆菌VBNC态的检测

步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养，检测诱导过程中乳杆菌的可培养活菌数；

D.荧光显微镜检测样品处理

步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，离心收集菌泥，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；

E.荧光染料溶液配制

将荧光染料SYTO-9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜中，得到贮存浓度为50μM的SYTO-9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；

F.乳杆菌荧光样品制备

步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL或50μL悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤E配制的荧光染料SYTO-9与PI溶液，立即将菌液与荧光染料混匀后甩至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；

吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；

G.荧光显微镜计数

在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活性细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；细胞的具体计数按照以下公式：

式中：

E为样品中乳杆菌活性细胞数，个/mL；S₁为盖玻片面积，mm；S₂为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A中，收集活化乳杆菌菌泥是在转速10000r/min下离心分离5～10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C中，MRS琼脂培养基倾注平板在温度37℃的条件下恒温静置培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A和D中，在用灭菌生理盐水洗涤菌泥时，以克计菌泥与以毫升计灭菌生理盐水的比是1：3～5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤F中，向乳杆菌悬浮液中加入0.6倍体积的荧光染料SYTO-9与0.4倍体积的荧光染料PI。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤F中，所述的抗荧光淬灭封片剂是选自碧云天公司的P0126抗荧光淬灭封片剂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于干酪乳杆菌Zhang在灭菌生理盐水中在温度4℃的诱导条件下第80天进入VBNC态；所述乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，并保持完整细胞结构。