[发明专利]一种荒漠植物霸王的微卫星分子标记及其应用

权利要求书

1.一种蒺藜科植物霸王的微卫星位点，包括SEQ ID NO1～SEQ ID NO9的序列的任意一种。

2.一种蒺藜科植物霸王的微卫星位点的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的序列依次为序列表SEQ ID NO10～NO27的序列。

3.一种如权利要求1所述霸王的微卫星位点的筛选方法，包括以下步骤：

1)收集样品并提取DNA；

2)对步骤1)获得的DNA片段化处理，构建DNA-seq文库，并对所述DNA-seq进行高通量测序；

3)检测微卫星位点并设计微卫星位点的引物对；

4)筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对。

4.一种如权利要求2所述特异性引物对的筛选方法，包括以下步骤：

1)收集样品并提取DNA；

2)对步骤1)获得的DNA片段化处理，构建DNA-seq文库，并对所述DNA-seq进行高通量测序；

3)检测微卫星位点并设计微卫星位点的引物对；

4)筛选并检测微卫星位点及其特异性引物对。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中提取DNA步骤为CTAB法。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述DNA-seq高通量测序使用illuminaHiseq测序平台进行高通量测序。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述DNA-seq高通量测序采用illuminaHiseq测序平台的双端测序模式。

8.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)检测微卫星序列并设计微卫星引物包括以下步骤：

采用batchprimer3在线分析工具对所述步骤2)组装完成的序列检测微卫星位点序列并在微卫星位点的侧翼序列上进行引物设计；

所述微卫星位点检测的条件为重复单元为2个碱基时，重复次数需大于等于6；重复单元为3个碱基时，重复次数需大于等于5；重复单元为4、5和6个碱基时，重复次数需大于等于4；

所述微卫星位点的引物设计的原则为PCR扩增目的片段为100～200bp，引物GC含量为40～60％，上下游引物退火温度(Tm)在50～60℃之间且差异小于5℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中筛选微卫星特异性引物的方法为：使用霸王DNA对步骤3)获得的特异性引物对进行PCR扩增并检测，筛选能够稳定扩增出目标条带并具有多态性的引物对。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增微卫星位点的PCR反应体系如下：2×Taq PCR SuperMix15μL，10μM上游引物使用荧光标记的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，用超纯水补齐至30μL；

所述扩增微卫星位点的PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30sec，适宜退火温度下退火30sec，72℃延伸30sec，反应34个循环；72℃延伸10min。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微卫星特异性引物检测方法为：使用1％琼脂糖-EB凝胶电泳检测步骤4)所述的PCR产物，挑选在霸王个体中均扩增得到单一目标条带的微卫星PCR产物进行基因分型分析；基因分型的结果使用GENMARKER软件进行读取，并输入Excel文件；使用Excel Mircosatellite Tool kit程序统计各微卫星位点的期望杂合度(Expected Heterozygosity,HE)、观测杂合度(Observed Heterozygosity，HO)和多态性信息含量(Polymorphic information content,PIC)，以检测所述微卫星位点的多态性状况，筛选出上述三个多态性数值均大于0.5的微卫星特异引物。

12.如权利要求2所述的霸王的微卫星特异性引物在霸王属蒺藜科植株基因的标记、定位与QTL分析，品种鉴定，种群及进化研究，分子标记辅助育种中的应用。