[发明专利]一种分子接头及其应用

说明书

本发明在优化illumina测序接头基础上，设计出具有稳定性好、与样本DNA连接效率高、具有校正功能的分子接头。该分子接头能够检测突变频率低至0.05％突变位点。该分子接头用于鉴别样本测序文库构建过程中真实突变和操作过程引入的假阳性突变，此外，提供一种构建待测样本测序文库的方法。

技术领域

本发明涉及测序技术领域，用于受检样本建库中的分子接头及应用；同时应用于超低频基因突变检测的分子接头及应用；尤其是具有鉴别功能的分子接头制备及构建待测样本测序文库的方法。

背景技术

肿瘤是异质性细胞的混合体，测序可以检测其中的罕见突变，二代测序具有多样本、多基因的优势，同时还可以发现未知的突变位点，所以二代测序可以用于肿瘤的早期筛查和诊断，复发监控，疗效评估等。

ctDNA是肿瘤患者体液中游离的DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，来自于肿瘤细胞坏死或凋亡等过程释放,存在于血液、尿液、脑脊液等体液中。ctDNA释放入血，携带有肿瘤的相关信息，因此通过ctDNA的检测可以反映肿瘤相关基因的特异性变异，进而了解肿瘤的特征。

因血浆中ctDNA含量极低，实验过程复杂，样本用量及实验次数受限制，且样本准备及测序前期文库构建及杂交捕获过程中存在损失，因此利用高通量测序(二代测序)技术获取的有效数据率偏低；加之血浆中ctDNA样本容易受基因组DNA的污染，导致测序背景噪音过高；此外测序过程中文库富集、后续的杂交捕获及测序都存在不同程度的氧化损伤，产生假阳性突变，将掩盖样本中的罕见突变,特别是血浆中有限的ctDNA，限制了检测灵敏度。因此受检样本连接上传统的接头只能通过分子标签区分不同的样本，然而因样本DNA量太低、背景信号过高、假阳性突变等原因，数据分析时很难剔除干扰，无法真实反映样本DNA所携带的肿瘤信息，尤其是ctDNA的检测。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的是根据illumina测序平台，优化illumina测序接头设计出具有稳定性好、与样本DNA连接效率高、具有校正功能的分子接头。该分子接头能够检测突变频率低至0.05％突变位点。

一种分子接头，该分子接头是呈钥匙状结构的核苷酸序列，包括非互补环状序列、互补双链序列和位于互补双链序列5’端的校正标签，

(1)非互补环状序列中脱氧尿嘧啶dU两侧序列包含

CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG；

(2)互补双链序列3’端含有能够与随机碱基互补配对的延伸区且3’端经化学修饰为具有防止核酸酶降解的功能；

(3)互补双链序列5’-3’依次为保护碱基、酶切识别碱基、4-12个随机碱基。

(4)校正标签5’→3’由保护碱基和4-12个随机碱基组成，且5’端经化学修饰为具有防止核酸酶降解的功能。

在一种实施方式中，所述非互补环状序列长度为42-54bp，所述互补双链序列长度为10-22bp。

在一种实施方式中，所述校正标签5’端经磷酸基团修饰；所述互补双链序列3’端倒数第一个碱基与倒数第二个碱基之间硫化修饰。

在一种实施方式中，校正标签中为8个随机碱基。

在一种优选的实施方式中，分子接头序列为:

PHO-5’-TTCTACAGTACNNNNNNNNAGATCGGAAGAG.....CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG....CTCTTCCGATC*T-3……