[发明专利]一种分子接头及其应用

权利要求书

1.一种分子接头，其特征在于，该分子接头是呈钥匙状结构的核苷酸序列，包括非互补环状序列、互补双链序列和位于互补双链序列5’端的校正标签，

(1)所述非互补环状序列中脱氧尿嘧啶dU两侧序列包含

CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG；

(2)所述互补双链序列3’端含有能够与随机碱基互补配对的延伸区且3’端经化学修饰为具有防止核酸酶降解的功能；

(3)所述互补双链序列5’-3’依次为保护碱基、酶切识别碱基、校正标签；且5’端经化学修饰为具有防止核酸酶降解的功能；

(4)所述校正标签由4-12个随机碱基组成。

2.根据权利要求1所述的分子接头，其特征在于，所述非互补环状序列长度为42-54bp，所述互补双链序列长度为10-22bp。

3.根据权利要求1所述的分子接头，其特征在于，所述校正标签5’端经磷酸基团修饰；所述互补双链序列3’端倒数第一个碱基与倒数第二个碱基之间硫化修饰。

4.根据权利要求1所述的分子接头，其特征在于，所述校正标签中为8个随机碱基。

5.根据权利要求1所述的分子接头，其特征在于，所述的分子接头序列为：PHO-5’-TTCTACAGTACNNNNNNNNAGATCGGAAGAG.....CACACGTCTGAACTCCAGTCACdUACACTCTTTCCCTACACGACG....CTCTTCCGATC*T-3’......

其中，PHO代表5’端磷酸化，N表示A/T/G/C中任何一个碱基，dU代表脱氧尿嘧啶，dU左边与右边下划线为互补区域，*代表硫化修饰，虚线“......”代表延伸区，5’端ACAGT为限制性内切酶识别区。

6.一种构建待测样本测序文库的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的分子接头作为测序文库的接头，然后执行：

1）加入DNA聚合酶，梯度退火延伸后用能够产生T粘性末端的限制性内切酶酶切并纯化；

2）样本DNA打断，制备DNA混合物，DNA末端修复；

3）接头连接：接头与末端修复后的DNA连接；

4）USER酶切除脱氧尿嘧啶dU；

5）文库DNA引入上机barcode序列，PCR扩增；

6）PCR扩增之后的文库经测序并获取测序数据。

7.根据权利要求6所述的构建待测样本测序文库的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述的梯度退火中所用的退火延伸步骤见下表：

。

8.根据权利要求6所述的构建待测样本测序文库的方法，其特征在于，在步骤3）中所述的接头与末端修复后的DNA摩尔比为15:1；在步骤5）中所述的barcode序列长度为6-8bp；在步骤6）对所述的PCR扩增之后的文库进行150bp双端测序。

9.权利要求1-5任一项所述的分子接头的应用，其特征在于：该分子接头用于鉴别样本测序文库构建过程中真实突变和操作过程引入的假阳性突变。

10.权利要求1-5任一项所述的分子接头的应用，其特征在于：该分子接头连接血浆游离DNA或组织DNA。