[发明专利]一种转基因黑点青鳉的制备方法

权利要求书

1.一种转基因黑点青鳉的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：

1)CYP1A启动子序列的改造；

2)Tol2转座子系统敲入质粒的构建和显微注射样品的制备；

3)黑点青鳉胚胎的显微注射技术和继代培养。

2.如权利要求1所述一种转基因黑点青鳉的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述CYP1A启动子序列的改造的具体方法如下：

(一)含6个DRE的CYP1A启动子的改造：根据已知的斑马鱼基因组序列设计引物，在序列两端添加XhoI、HindⅢ两个酶切位点，采用常规分子克隆的方法和overlap PCR技术，克隆并改造得到含6个DRE的CYP1A启动子；

改造后PGL6-TA-pCYP1A-6×DRE序列如下：

(二)含12个DRE的CYP1A启动子的改造：

(1)选取斑马鱼CYP1A基因启动子中两个含有多DRE的区域，设计以下引物：

12×DRE-1F：5’-CGCGGATCCAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(BamHI)

12×DRE-1R：5’-AAAGATATCATTGCCTGCATGTTTGAG-3’(EcoRV)

12×DRE-2F：5’-AAAGATATCCCTTTAATCAGGGGTCGCC-3’(EcoRV)

12×DRE-2R：5’-CTAGTCTAGACCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(XbaI)

以斑马鱼基因组DNA为模版分别进行普通PCR后，切胶回收得到序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列如下：

序列12×DRE-1：

序列12×DRE-2：

(2)把序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列分别用限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)37℃酶切过夜后，切胶回收片段，同时用限制酶(BamHI和EcoRV)与(EcoRV和XbaI)对pCMV-C-EGFP质粒酶切并回收片段，最后用T4DNA连接酶将序列12×DRE-1和序列12×DRE-2两段序列与质粒连接，得到pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP重组质粒；

(3)以重组质粒pCMV-C-pCYP1A-12×DRE-EGFP为模版，设计引物12×DRE-F和12×DRE-R，进行PCR添加酶切位点，引物序列如下：

12×DRE-F：5’-CGCCTCGAGAAGCCGAACAGGAGGGTA-3’(XhoI)

12×DRE-R：5’-CTAGAAGCTTCCGGAGCGATCGAGTGGATA-3’(HindIII)

切胶回收后pCYP1A-12×DRE序列如下：