[发明专利]IL7R基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种IL7R基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法，IL7R基因缺失斑马鱼突变体的构建是通过CRISPR/Cas9技术实现的。另外，本发明还公开了IL7R基因缺失斑马鱼突变体的应用，本发明的突变体模型可用于研究IL7R在神经系统发育及髓鞘形成中的作用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基因敲除的斑马鱼突变体，具体涉及IL7R基因缺失斑马鱼突变体及其制备方法和应用。

背景技术

白细胞介素7受体(interleukin 7receptor,IL7R)属于Ⅰ型细胞因子受体家族成员的跨膜受体，由α链(IL7Rα，CD127)和γ链(γc，CD132)组成，α链是IL7R的特异性组分；γ链是IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、IL21等细胞因子受体的共同组分，也被称为共有γ链，是启动IL7R下游信号表达的必需成分。生理情况下，IL7R是淋巴细胞增殖和分化的必需关键因子；病理情况下，IL7R功能缺陷可导致重症联合免疫缺陷病，而IL7R获得性突变可引起急性T淋巴细胞白血病等。

成簇规律间隔短回文重复系统(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease(Cas)，CRISPR/Cas)系统是细菌或古细菌在长期演化过程中形成的抵御外来遗传物质的一种获得性免疫防御机制，能够识别自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/Cas系统有3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中II型CRISPR/Cas系统只需要一个Cas9核酸内切酶切割DNA双链，即CRISPR/Cas9系统。在向导RNA(single guide,sgRNA)指导下，Cas9内切酶像剪刀一样对特定基因、特定位点进行靶向性剪切，形成双链DNA缺口，细胞可以通过同源重组修复或者非同源性末端连接对断裂DNA进行修复，从而实现对基因的编辑。作为一种新兴基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有实验简单、操作容易和节省时间等优势。利用CRISPR/Cas9技术在酵母、拟南芥、小鼠、大鼠、果蝇、青蛙等不同物种都成功进行了基因定向改造。在斑马鱼研究领域，CRISPR/Cas9系统也被广泛应用于精确和靶向性的基因编辑。在单细胞胚胎阶段通过注射sgRNA和Cas9 mRNA能够快速、高效获得基因敲除斑马鱼突变体，并且可以遗传给子代，这大大拓展了在斑马鱼中进行基因功能缺失的研究。

申请人先在幼鱼脱髓鞘模型上以基因芯片进行了表达谱分析，在获得的差异表达基因中，申请人发现，IL7R表达显著降低，提示IL7R可能与神经系统的发育有密切关系。斑马鱼的IL7R和人类IL7R的相似度为73％，利用IL7R基因敲除突变体进行研究是一个有效途径，然而，目前国内外尚无报道。申请人认为，有必要构建IL7R基因敲除斑马鱼突变体，并以此为模型对IL7R在神经系统发育及髓鞘形成中的作用进行在体实验研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种sgRNA片段以及使用该sgRNA片段构建IL7R基因缺失斑马鱼突变体的方法。为此，发明人进行了大量的实验，在众多sgRNA中筛选出活性最高的一种sgRNA并将其用于突变体的构建中，从而获得了稳定遗传的IL7R基因缺失斑马鱼突变体。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种sgRNA片段，所述sgRNA的DNA序列如5-’ACTCCACTCACTCCAGTCACCGG-3’所示，其中3’端的CGG为PAM识别位点。

本发明提供了一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的sgRNA。使用该试剂盒可以用于IL7R基因表达的沉默。