[发明专利]IL7R基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用

权利要求书

1.一种sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA的DNA序列为5-’ACTCCACTCACTCCAGTCACCGG-3’。

2.一种基因打靶试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的sgRNA。

3.一种基因敲除方法，其特征在于，利用权利要求1所述的sgRNA片段识别目的基因上的双链上的不同靶位点，与一种核酸酶结合并通过识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行随机剪切，随后从切口处脱落，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。

4.根据权利要求3所述基因敲除方法，其特征在于，所述sgRNA片段与核酸酶发挥作用的数量为一个或以上。

5.一种IL7R基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)将权利要求1所述的sgRNA和Cas9 mRNA共同导入斑马鱼中；

(2)培养获得稳定遗传的IL7R基因缺失斑马鱼突变体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA的获得步骤如下：

(1)确定IL7R基因敲除的靶位点；

(2)根据步骤(1)确定的靶位点序列设计扩增引物，PCR获得sgRNA的体外转录的模板；

(3)根据步骤(2)获得的模板进行体外转录。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA的获得步骤如下：

(1)查询斑马鱼IL7R基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对IL7R基因的靶位点；

(2)PCR法获得sgRNA的体外转录的模板，正向引物序列为：5’TAATACGACTCACTATAGACTCCACTCACTCCAGTCACgttttagagctagaaatagc-3’，前18位碱基序列是T7启动子，19-38位碱基序列是sgRNA靶序列，小写字母表示的碱基序列为sgRNA上游骨架；反向引物序列为25bpsgRNA下游骨架，序列为5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，按照下列PCR条件进行扩增：预变性95℃3min；变性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃20s进行35个循环，再72℃10min；PCR产物回收纯化；

(3)以RNA体外转录试剂盒进行体外转录。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA是按照以下步骤获得的：

以T7驱动的人源化的Cas9编码序列为模板，用T7 RNA聚合酶进行Cas9体外转录，然后戴帽并加polyA尾；RNA经无水乙醇法沉淀，用DEPC处理过的超纯水重悬。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，sgRNA和Cas9 mRNA共同导入斑马鱼中，包括：将sgRNA和Cas9 mRNA混合，sgRNA终浓度为50ng/μL、Cas9 mRNA终浓度为250ng/μL，在斑马鱼胚胎1-4细胞期进行显微注射，注射量为1nL。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，培养获得稳定遗传的IL7R基因缺失斑马鱼突变体，包括：

(1)对经过注射的斑马鱼进行基因型鉴定，确定IL7R基因敲除的初建者F0；

(2)IL7R基因敲除的初建者F0个体进行自交获得F1；

(3)利用基因型鉴定的方法确定IL7R基因敲除的F1；

(4)从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；

(5)鉴定为F2代中IL7R基因敲除的纯合子即为稳定遗传的IL7R基因缺失斑马鱼突变体。