[发明专利]一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现龟甲胶中龟、牛源性成分的快速检测。本发明的检测方法能够快速的检测到龟甲胶及其制品中龟、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。属于胶类中药动物源性检测技术领域。

背景技术

龟甲胶为龟科动物乌龟的背甲及腹甲，经水煎熬、浓缩制成的固体胶。味咸、甘，微寒，归肝、肾和心经，具有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效，主要用于阴虚潮湿，骨蒸盗汗，头晕目眩，虚风内动，筋骨痿软，心虚健忘等。长期服用龟甲胶利于增强机体自身调节，延年益寿，利于阴虚阳亢患者的身体恢复。随着生活水平的不断提高，龟甲胶成为人们进补的首选之一。

据2015年版《中国药典》记载，龟甲胶为龟甲经水煎熬、浓缩制成的固体胶。由于龟甲属于名贵药材，加上近年来对各种龟类动物的严重捕杀，致使龟甲原料的供应有限，随着胶类市场的不断发展，熬胶原料紧缺和原料价格的上涨，部分生产商制作原料用其他动物的杂皮包括猪皮、牛皮等、碎骨代替龟骨，以次充好。这些假冒伪劣产品无论是在外观、色泽和气味上都与正品龟甲胶无明显差别，肉眼很难辨别真假。若消费者长期服用这些伪劣产品，不仅没有任何的治疗效果，服用时间久了还有可能对身体造成伤害。劣质龟甲胶产品的出现影响了整个龟甲胶产业链的健康发展。这就要求发展更加可信、灵敏的检测技术来满足监管部门的质量控制与监管要求。

随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量PCR检测整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的风险，目前广泛应用于各个领域。

目前，龟甲胶中以DNA为基础的溯源鉴定工作在不断展开。专利CN103630646A通过质谱法快速鉴别龟甲胶中龟源性成分，专利授权号（CN 103630634A）通过加入限制性内切酶后利用质谱法快速鉴别龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪或羊源性成分。但这些方法均针对龟甲胶中多肽差异性进行鉴定，而由于技术的局限性，灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上不够准确。因此，传统的鉴别方法不能满足当前龟甲胶真伪鉴别的要求。而利用实时荧光定量PCR检测龟甲胶中龟、牛源性的研究目前在国内还尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物，包括两对引物，其核苷酸序列如下：

（1）龟特异性引物：

正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’；

反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’；

（2）牛特异性引物：

正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’；

反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’。

一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测探针，包括：