[发明专利]一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用

权利要求书

1.一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物及探针，其特征在于，检测引物，其核苷酸序列如下：

（1）龟特异性引物：

正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’；

反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’；

（2）牛特异性引物：

正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’；

反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’；

检测探针，包括：

龟特异性探针P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’；

牛特异性探针P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’；

龟特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

2.一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物、探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。

3.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：

（1）质控体系IsqcP序列：

CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA；

（2）质控体系引物：

上游引物F：5’- CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA -3’；

下游引物R：5’- CTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCGA -3’；

（3）质控体系探针CntP：5’-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3’。

4.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括龟和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。

5.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系包括：2×qPCR Master Mix 10×10μL，龟特异性引物F1/R1mix 5μM取1μL，牛特异性引物F2/R2 mix 5μM取1μL，质控体系引物F/R mix 2～5μM取1μL，龟特异性探针P1/牛特异性探针P2/质控体系探针CntP mix 2μM 取1μL，含有质控体系IsqcP序列的质粒DNA0.01ng/μL取1μL，DNA用量1～20ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。

6.权利要求2所述的试剂盒在鉴别龟甲胶中龟和牛源性成分中的应用。

7.一种龟甲胶中龟、牛源性多重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；

（2）使用权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；

（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定龟甲胶中是否含有龟和牛源性成分。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中的PCR扩增条件为：95℃3min； 95℃ 10s，62℃ 35s，在此收集荧光信号，45个循环。