[发明专利]一种羧肽酶A固定化酶的制备方法

说明书

本发明涉及一种羧肽酶A固定化酶制备的方法。发明采用树脂AB‑8为载体对酶进行吸附‑交联复合固定化，经优化得到的最佳固定化条件：吸附温度35℃、吸附时间12h、戊二醛浓度0.35％、交联时间1h、交联温度25℃。酶固定化后其性质为：最适pH为7.0，最适温度40℃，与固定化前基本保持一致，且温度稳定性提高5℃。采用固定化酶降解赭曲霉毒素A，其K_m值为11.50μg/ml，V_max为97.09μg/mg，K_cat值为324。酶固定化后，其酶促反应的V_max无显著下降，催化效率与高于未固定的酶。与现有技术相比，本发明提供的方法工艺简单、成本低，且具有酶性质稳定、固定化效率高和酶活回收率高等特点。

技术领域

本发明涉及一种羧肽酶A固定化的制备方法，属于固定化酶技术，适用于医药、食品等工业领域。

背景技术

羧肽酶是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中，羧肽酶发挥着重要的生理功能，被广泛应用于医药、食品等工业领域。羧肽酶A是一类存在于细胞外的金属羧肽酶，在中性或弱碱性条件下具有极大活性能释放C末端氨基酸(除脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸和赖氨酸)，对具有芳香族侧链和大脂肪侧链的羧基端氨基酸具有很强水解能力。在医药领域，由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应，可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的，可用于体内不良物质(毒素等)的降解。在食品工业，可用于食品和饲料中赭曲霉素(OTA)的去除、制备高F值寡肽、用作脱苦味剂等。羧肽酶A是最早被发现能够降解OTA的一种酶，其降解产物为赭曲霉毒素α和L-β-苯基丙氨酸，且无进一步的降解，产物对机体基本无毒性。因此羧肽酶A常被用于食品工业中去除OTA。然而游离的羧肽酶A稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后分离纯化困难，使其难以更为广泛的实际应用。此外，分离和提纯酶以及重复使用性差又大大增加了其作为催化剂的成本。因此，固定化羧肽酶A是实现其在实际中应用的关键。

目前羧肽酶的固定化研究除了传统的固定化方法外主要集中在定点固定化方面，但这种固定化酶的方式成本较高，不适宜应用于医药、食品领域应用；而目前传统的物理化学固定化方法应用存在诸多问题。如物理吸附法中酶与载体相互作用力弱、酶易脱落，反复利用性差；包埋法容易发生化学聚合反应，导致酶活力损失，并且该方法要求底物和产物是可以自由通过高分子凝胶的网格扩散的小分子，限制了大分子的酶和底物的应用等。而化学法固定化方法的缺点是载体需要活化及提前处理；固定化操作比较复杂；反应条件比较强烈；化学修饰时易造成酶失活；蛋白质通过氨基酸侧链功能基团参加共价连接往往会引起酶分子的结构变化从而导致活力降低，需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单可实际应用的羧肽酶固定化方法，该方法具有工艺简单、成本低，固定化酶性质稳定、固定化效率高和酶活回收率高等特点。

本发明通过羧肽酶A吸附-交联复合的固定化方案实现，其步骤如下：

(1)酒精浸泡活化AB-8树脂作为固定化材料；

(2)将(1)中活化的材料加入磷酸缓冲液，调pH为6.0至8.0，在一定温度条件下，将羧肽酶与固定化载体进行吸附；

(3)将吸附酶后的载体在一定温度下采用戊二醛交联；

(4)将(2)中所得的固定化酶冷冻干燥后即可。

所述步骤(2)中活化的材料加入的磷酸缓冲液体系，pH为7.5。

所述步骤(2)中羧肽酶与固定化材料进行吸附的温度为20～45℃；吸附时间为3～18h

所述步骤(3)中羧肽酶与固定化材料进行交联的戊二醛浓度为0.05～0.55％、交联时间1～6h、交联温度为4～37℃。