[发明专利]一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒，属于病毒疫病诊断技术领域；所述引物是根据GenBank公布的家蚕BmBDV病毒VP序列的保守区域设计；提取BmBDV病毒DNA后，采用包含所述引物的与反应液进行LAMP反应，在反应结束后利用核酸染料SYBR Green I颜色变化判定结果，结果显示在62℃反应30min后，BmBDV病毒DNA获得了高效特异性扩增，同常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且可用于生产一线的技术人员和蚕农现场使用，有利于该病毒病的诊断与预防。

技术领域

本发明涉及一种检测家蚕二分浓核病毒的LAMP引物及其试剂盒，具体涉及一组环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术检测家蚕BmBDV病毒引物及其试剂盒，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术

家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科浓核病毒亚科。BmBDV主要感染家蚕，病毒感染的家蚕幼虫的症状包括厌食、腹泻及软化，体型消瘦，出现迟眠、胸部半透明的空头等现象最终停止进食。该病毒具有高致死率，感染持续时间较长，引起慢性蚕病，是我国夏秋季节蚕茧等经济产品减产的重要原因之一。

研究表明，BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20-24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号DQ017268和DQ017269）。目前该病毒的检测方法有电镜法、PCR检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，反应时先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增。该技术简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、染料显色法和荧光染料观察等方法。

琼脂糖凝胶电泳和荧光染料观察需要专门的设备，浊度观察在含量较低时也较难观察，核酸染料直接显色法比较适合现场快速检测需求。目前常用的核酸染料有钙黄绿素（Calcein）、SYBR Green、羟基萘酚蓝（HNB）、Eva Green等。利用核酸染颜色的变化来判定检测结果，这种方法具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。目前，该方法在家蚕BmBDV的检测中未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一组检测BmBDV病毒的LAMP的引物，并提供一种用于检测家蚕的BmBDV病毒的LAMP检测试剂盒。该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合家蚕BmBDV的筛查。

本发明所述的引物是根据GenBank公布的BmBDV VP序列（Accession number: YP_007714630.1）设计修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出三对引物：

引物BmBDV-F3（SEQ ID NO:1）：TCTGACGTTGGTGGAAGT

引物BmBDV-B3（SEQ ID NO:2）：AACTTGCTTTCCACTCGA

引物BmBDV-FIP（SEQ ID NO:3）：