[发明专利]一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇及其检测的方法

说明书

一、技术领域

本发明提供了一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇及其检测的方法，属于食品分析检测领域。

二、背景技术

麦角甾醇(Ergosterol)的化学名称为24β-甲基胆固醇-5，7烯-3β-羟基，又称麦角固醇，常温下是固体，熔点为156～158℃，23℃时旋光度为127.5(C＝1.2，CHCl₃)，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、石油醚、庚烷等有机溶剂。该物质在石油醚中为无水晶体，在乙醇中呈现片状。麦角甾醇是一种重要的医药化学原料，是产生维生素D₂的前体，也可作为生产激素类药物的中间体，用来生产可的松。对于微生物而言，其主要存在于真菌体内，包括丝状真菌和酵母。作为细胞膜的重要组成部分，麦角甾醇对真菌细胞膜的完整性、膜结合酶活性，膜流动性，细胞活力以及细胞物质运输等都起着十分重要的作用。

米根霉是自然界中广泛存在的一类丝状真菌，属于藻菌纲(Phycomcetes)、毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucoraceae)、根霉属(Rhizopus Ehrenberg)、根霉种(Rhizopus spp.)，千百年来，一直是我国传统发酵食品的重要优势菌种。在特定条件下，米根霉能够利用原料代谢产生L-乳酸、L-苹果酸、富马酸和脂肪酸，具有很高的经济价值。通常，该种霉菌的生长温度为30℃～35℃，菌落疏松或稠密，颜色起初为白色，之后变为灰褐色至黑褐色，假根发达，呈指状或根状分支，发酵过程中因具有较强的分泌糖化酶的能力，多被应用于高淀粉原料的固态发酵中。

本专利以谷物为原料，在微生物固态发酵的基础上，采用有机试剂萃取法、高效液相色谱(HPLC)分析技术，对米根霉发酵产生的麦角甾醇进行提取、检测。该发明的合成、提取、检测方法不但简单、准确，而且适用范围广，可以低成本、大批量生产麦角甾醇，为麦角固醇的生物合成和分析检测提供了一种重要手段，具有明显的社会价值和经济效益。

三、发明内容

本发明主要开发一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇并对其进行提取、检测的方法，以燕麦、大麦、青稞等谷物为原料，在米根霉固态发酵的基础上，利用有机试剂萃取麦角甾醇，并通过HPLC法进行检测。

技术方案：以燕麦、大麦、青稞等谷物为原料，浸泡、煮沸后接种一定比例的米根霉发酵剂，固态发酵，有机试剂溶解、萃取发酵底物中富集的麦角甾醇，采用HPLC法检测其含量，以上方法为：

A、原料的预处理：称取颗粒饱满的谷物仁，加入2-5倍水(以谷物质量倍数计)和0.5-2％乳酸(以水的体积倍数计)，20-25℃室温下浸泡6-12h；

B、煮沸、分装：将浸泡后的谷物排出水分，转移至2-5倍沸水中(以吸水后谷物质量倍数计)，煮沸8-13min，沥干谷物，分装在160℃热处理2h之后的无菌不锈钢盆中；

C、接种、发酵：以0.5-2％(以煮制后谷物质量百分比计)的比例在谷物中接种米根霉发酵剂，使米根霉的孢子浓度为10⁴-10⁶个/g(以煮制后谷物质量浓度计)，混匀，保鲜膜密封，在每cm²(以保鲜膜实际使用面积计)上戳0.1-0.3个孔，放入温度为28-32℃、湿度为75-95％的恒温恒湿培养箱中，发酵72-120h；

D、发酵产物处理：将发酵产物混匀，垂直取样10-20g，捣碎移入三角瓶中，依次加入30-60mL甲醇、20-40mL 95％乙醇和5-10g氢氧化钾，沸水浴加热15-25min，再加入15-30mL蒸馏水轻轻摇匀；

E、麦角甾醇提取：取5-10mL以上混合液，加入等体积(以吸取的混合液体积计)的正戊烷，振荡萃取2-5min，静置后收集上清液，重复两次，将收集的含有麦角甾醇的上清液在30℃、100rpm/min条件下旋转蒸发2-5min，浓缩产物用0.2-2mL甲醇复溶，过0.45μm有机系滤膜后待测；