[发明专利]一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇及其检测的方法

权利要求书

1.一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇及其检测的方法，其特征在于，以燕麦、大麦、青稞等谷物为原料，浸泡、煮沸后接种0.5-2％的米根霉发酵剂，28-32℃、湿度为75-95％条件下，固态发酵72-120h，有机试剂溶解、正戊烷萃取发酵底物中富集的麦角甾醇，采用HPLC法测定其含量，其方法为：

A、原料的预处理：称取颗粒饱满的谷物仁，加入2-5倍水(以谷物质量倍数计)和0.5-2％乳酸(以水的体积倍数计)，20-25℃室温下浸泡6-12h；

B、煮沸、分装：将浸泡后的谷物排出水分，转移至2-5倍沸水中(以吸水后谷物质量倍数计)，煮沸8-13min，沥干谷物，分装在160℃热处理2h之后的无菌不锈钢盆中；

C、接种、发酵：以0.5-2％(以煮制后谷物质量百分比计)的比例在谷物中接种米根霉发酵剂，使米根霉的孢子浓度为10⁴-10⁶个/g(以煮制后谷物质量浓度计)，混匀，保鲜膜密封，在每cm²(以保鲜膜实际使用面积计)上戳0.1-0.3个孔，放入温度为28-32℃、湿度为75-95％的恒温恒湿培养箱中，发酵72-120h；

D、发酵产物处理：将发酵产物混匀，垂直取样10-20g，捣碎移入三角瓶中，依次加入30-60mL甲醇、20-40mL 95％乙醇和5-10g氢氧化钾，沸水浴加热15-25min，再加入15-30mL蒸馏水轻轻摇匀；

E、麦角甾醇提取：取5-10mL以上混合液，加入等体积(以吸取的混合液体积计)的正戊烷，振荡萃取2-5min，静置后收集上清液，重复两次，将收集的含有麦角甾醇的上清液在30℃、100rpm/min条件下旋转蒸发2-5min，浓缩产物用0.2-2mL甲醇复溶，过0.45μm有机系滤膜后待测；

F、麦角甾醇测定：配制浓度为0、5、10、20、50、100、200μg/mL的麦角甾醇-甲醇标准溶液(以甲醇体积浓度计)，HPLC检测，条件为：C18色谱柱，可变波长检测器(VWD)，进样量20μL，检测波长为282nm，流动相为甲醇，流速为1-2mL/min，麦角甾醇的出峰时间在5-8min，其浓度与峰面积呈线性相关，通过绘制麦角甾醇标准品浓度与峰面积的线性方程，将样品峰面积代入计算，可得出米根霉固态发酵产物中的麦角甾醇浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，称取一定量的谷物仁，加入2-5倍含有0.5-2％的乳酸-水溶液，20-25℃室温下浸泡6-12h，所述乳酸-水溶液添加量和乳酸浓度分别以谷物质量和水的体积计。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将浸泡后的谷物排出水分，转移至2-5倍沸水中，煮沸8-13min，沥干谷物，分装在160℃热处理2h之后的无菌不锈钢盆中，沸水量以吸水后谷物质量计。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在谷物中接种0.5-2％米根霉发酵剂，使米根霉的孢子浓度为10⁴-10⁶个/g，混匀，保鲜膜密封，在每cm²上戳0.1-0.3个孔，放入温度为28-32℃、湿度为75-95％的恒温恒湿培养箱中，发酵72-120h，接种量、孢子浓度以煮制后谷物质量计，戳孔密度以保鲜膜实际使用的面积计。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将发酵产物混匀，垂直取样10-20g，捣碎移入三角瓶中，依次加入30-60mL甲醇、20-40mL 95％乙醇和5-10g氢氧化钾，沸水浴加热15-25min，再加入15-30mL蒸馏水轻轻摇匀，乙醇浓度以水的体积计。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，取5-10mL以上混合液，加入等体积的正戊烷，振荡萃取2-5min，静置后收集上清液，重复两次，将收集的含有麦角甾醇的上清液在30℃、100rpm/min条件下旋转蒸发2-5min，浓缩产物用0.2-2mL甲醇复溶，过0.45μm有机系滤膜后待测，正己烷加入量以混合液体积计。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制浓度为0、5、10、20、50、100、200μg/mL的麦角甾醇-甲醇标准溶液，HPLC检测，条件为：C18色谱柱，可变波长检测器(VWD)，进样量20μL，检测波长282nm，流动相为甲醇，流速1-2mL/min，麦角甾醇的出峰时间在5-8min，其浓度与峰面积呈线性相关，通过绘制麦角甾醇标准品浓度与峰面积的线性方程，将样品峰面积代入计算，可得出米根霉固态发酵产物中的麦角甾醇浓度，麦角甾醇浓度以甲醇体积计。