[发明专利]细菌AB5肠毒素蛋白的定性、定量检测方法

说明书

本发明涉及细菌AB₅肠毒素蛋白的定性、定量检测方法，采用超滤法先提取待测样品中的蛋白，得到样品蛋白；将样品蛋白进行酶切；然后采用膜电喷雾电离质谱法进行AB₅肠毒素特异性肽段的检测，在肽段水平上定性、定量判定AB₅肠毒素编码基因的存在；其中所述AB₅肠毒素分别为Ctx、LT、Stx1和Stx2，其序列分别为SEQ ID NO.2所示、SEQ ID NO.3所示、SEQ ID NO.5所示、SEQ ID NO.7所示。本发明采用膜电喷雾电离质谱有效去除酶切引入小分子导致的基质效应，节省了常规质谱分析流程中的脱盐步骤，使得本发明可实现极高灵敏度下的快速检测。

技术领域

本发明涉及膜电喷雾电离质谱的应用，具体地说，涉及一种应用膜电喷雾电离质谱对细菌AB₅肠毒素蛋白的定性、定量检测方法。

背景技术

在世界范围内，肠道感染仍旧在疾病负担的贡献上扮演着重要的角色。由其所致的生产力减低、生活质量下降以及医疗费用的增加，显著的影响了经济发展。可以产生AB₅肠毒素的细菌性病原体在肠道感染中占据着重要地位。^[1]AB₅肠毒素由于包含A和B两个亚单位而得名，其中具有催化作用的A亚单位可以干扰宿主必须生理机能，而B亚单位则负责调节宿主受体的识别。^[2]

多种致泄性微生物都可以产生各自特异的AB₅肠毒素，例如：霍乱弧菌产生的霍乱毒素 (Cholera toxin，Ctx)，志贺氏菌产生的经典型志贺毒素(Shiga toxin，Stx)，产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin，LT)，产志贺毒素大肠杆菌产生的志贺毒素 1(Stx1)和志贺毒素2(Stx2)。^[3]虽然这些不同来源的AB₅肠毒素具有相似的结构骨架，但是他们在识别细胞表面糖受体以及介导细胞内的催化反应方面有所差异。霍乱毒素和不耐热肠毒素主要与分布在小肠上皮细胞膜上的神经节苷脂GM1相结合，导致感染的细胞离子调节失衡，进而促使机体发生严重的腹泻，甚至引起威胁生命的脱水和电解质紊乱。^[4,5]志贺毒素包括志贺毒素1和志贺毒素2，则与血管或肾内皮细胞表面表达的鞘磷脂Gb3表现出较强的亲和力，引起对内皮细胞的细胞毒性作用。志贺毒素同样可以导致严重的胃肠感染性疾病，如腹泻和出血性结肠炎，严重者可发展为溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜。^[6]每年AB₅肠毒素的感染危及到数百万人的生命健康，并且造成超过一百万人死亡。^[7]由于AB₅肠毒素严重的危害性，对临床样品中AB₅肠毒素检测的需求日益增加。