[发明专利]一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中位于第2外显子的第17个碱基处的SNP位点设计dCAPS引物，通过一个碱基错配引入酶切位点，进而使DNA自SNP位点切开，具有G→A突变的片段就被切成了22bp和226bp，没有G→A突变的SNP位点无法切开。因此根据酶切后226bp处电泳条带的有无即可判断该材料是否为具有G→A突变的陆地棉I式果枝。本发明通过一个SNP位点的差异就能鉴定出材料目的性状的区别，鉴定效率高；引入限制性内切酶酶切位点后，酶切出特异性条带，鉴定结果的准确度高；鉴定过程操作简单，可公式化，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及生物鉴定领域，具体地说，涉及一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法。

技术背景

果枝是指棉花植株上能结棉铃的分支，一般着生于主茎的中上部。I式果枝是棉花中有限果枝的一种，只有1到2个果节，节间很短。在棉花生产中，I式果枝品种一经打顶就终止了棉株果枝、果节的增多，使得营养集中供给棉铃，使棉铃加速发育，集中吐絮，具有更好的成熟一致性；另外果枝短，适于密植，省去了整枝管理环节，在管理过程中可以大幅度的降低人工，且更加适合机械化采摘。

然而，由于I式果枝为单隐性基因控制，其回交转育过程需要进行大量的自交鉴定试验确定棉株的果枝特征，耗费大量的时间、人力和物力，且正常果枝植株易受环境因素的影响变成类似于I式的果枝，在选育过程中从表型难以区分。因此，亟待设计一种简单方便，干扰因素小，准确度高的方法，能在育种过程中从杂合状态的单株中鉴定出含有陆地棉I式果枝基因的材料。

SNP(Single nucleotide polymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的突变所引起的基因多态性，在真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点，能直观的从遗传物质上反映不同个体的核苷酸序列上的差异。目前，随着棉花基因组测序的完成，越来越多的SNP标记得到开发和应用，本发明的关键核心也来自SNP位点的开发和应用。

SNP恰好位于限制性酶切位点的情况比较少见，在酶切扩增多态性序列(CAPS)标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性，这就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法可以将SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。

海岛棉中已经有了鉴定有限果枝中簇生铃果枝的基因鉴定方法，但是陆地棉与海岛棉属于不同的栽培种，染色体组分别为(AD)₁和(AD)₂。海岛棉中得到的鉴定方法并不适用于来源于陆地棉的I式果枝基因位点。陆地棉I式果枝的分子鉴定方法目前还没有报道。除了采用本发明提供的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法能鉴定陆地棉果枝类型外，目前还没有其他方法。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明提供一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，通过设计dCAPS引物并结合酶切技术将扩增片段从SNP位点处切开，进而得到特异性酶切片段，通过一个碱基差异即可鉴定陆地棉I式果枝共分离基因，并且鉴定准确度高，结果可靠。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对棉花进行DNA提取；

(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物，所述dCAPS引物如下：

正向引物SEQ ID No.1：5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’；

反向引物SEQ ID No.2：5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’；