[发明专利]基于模拟酶标记银纳米粒子的高灵敏化学发光免疫分析方法

说明书

一、技术领域

本发明为一种基于模拟酶标记银纳米粒子的高灵敏化学发光免疫分析方法，通过构建可抛式免疫传感芯片，设计新型DNA模拟酶标记银纳米粒子探针，实现化学发光信号放大，用于蛋白质的高灵敏高通量成像免疫分析。

二、背景技术

蛋白质标志物的检测在心血管疾病的临床诊断和监测中发挥着重要作用。免疫分析因其对生物分子高特异识别能力，在蛋白质标志物的检测中得到了广泛应用。作为最普及的免疫分析方法，酶联免疫分析需要专业人员操作，仪器复杂，步骤繁冗，耗时昂贵，这些缺点大大限制了它的进一步应用。

发展简单易操作、成本低、高通量的免疫分析方法，是蛋白质检测一直以来所追求的目标。在单个分析流程中同时或者类同时实现多个样品的检测，具有分析通量高、所需时间短、样品消耗少等突出优点，因此基于可抛式免疫传感芯片的免疫分析方法近年来得到了越来越多的关注。然而，常见的蛋白质阵列芯片多采用光刻技术、点阵技术或印刷技术制备而成，步骤非常复杂，而且需要配备相应机器，非专业人士很难完成。

此外在实际应用领域中，免疫分析对高灵敏方法的需求也与日俱增，为了实现对低丰度组分的准确检测，大多数免疫检测方法都选择将天然酶如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶负载到纳米粒子上实现信号放大，但天然酶常常因为微小的构象变化就影响它们的催化活性从而导致变质，而用于负载酶的纳米粒子如金纳米粒子、碳纳米管、石墨烯等，无论合成或生物修饰都条件苛刻、价格昂贵。

三、发明内容

本发明的目的是：用最简单的手工贴膜技术，构建可抛式免疫传感芯片，使非专业人士也能轻松开展高通量检测，同时设计一种DNA模拟酶标记的银纳米粒子探针，进行化学发光信号放大，两者结合，提出一种新型高通量高灵敏化学发光成像免疫分析方法。

本发明提出的高灵敏化学发光成像免疫分析方法如图1所示，由可抛式免疫传感芯片(1)、模拟酶标记银纳米粒子探针(2)和信号产生体系(3)构成，通过以下技术方案来制备：

1)可抛式多组分免疫传感阵列是通过手工贴膜技术，在醛基基片上获得4×12阵列，在每个传感池内包被一定量的捕捉抗体Ab1，抗体的氨基与醛基阵列上的芳香醛基共价结合，反应结束后冲洗，再滴加封闭液，封闭结束后冲洗，晾干，制得可捕捉目标抗原的阵列芯片(图2)；

2)模拟酶标记银纳米粒子探针是在银纳米粒子表面同时修饰信号抗体Ab2和高比例G-四链体DNA而制成，后者结合血红素形成模拟酶，如图3所示；

3)信号产生体系是利用模拟酶的过氧化物酶特性催化化学发光底物过氧化氢氧化鲁米诺的反应，产生强化学发光信号。

免疫分析方法的工作原理：

1)在可抛式免疫传感芯片的每个传感池表面滴加标准溶液或待检测样品，进行温育；

2)冲洗后，在每个传感池表面滴加模拟酶标记银纳米粒子探针，反应结束后冲洗；

3)在每个传感池表面滴加化学发光底物，通过电感耦合装置CCD相机进行化学发光成像检测；

4)每个传感池的化学发光信号与其所对应标准溶液的浓度成正相关，可据此获得工作曲线，求出待检测样品中目标蛋白质(抗原)的浓度，实现多个样品中蛋白质的同时高灵敏成像免疫分析。

上述的分析方法，封闭液为含5％牛血清白蛋白(BSA)的0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4；冲洗液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

本发明设计了模拟酶标记的银纳米粒子探针进行化学发光信号放大，通过可抛式免疫传感芯片，提出了一种高灵敏高通量化学发光成像免疫传感方法。相对于现有检测系统，具有以下特点：

(1)可抛式免疫传感芯片是以醛基基片为基底，手工贴膜、化学包被获得，制备简单、快速，成本低廉。利用空间分辨模式，48个阵列传感池可同时进行48个样品的免疫分析，具有通量高、稳定性和重现性好的优点。

(2)设计的纳米探针以银纳米粒子为负载物，原材料易获得、价廉，制备方法简单、条件温和，生物修饰过程易操作，保存稳定性好。

(3)设计新颖的表面负载有大量模拟酶的纳米探针，结合模拟酶对过氧化氢鲁米诺反应的催化作用，进行信号放大，提高检测灵敏度，使其更适于低丰度蛋白质的检测。

(4)该分析方法无需外加光源，设备和操作都非常简单。

四、附图说明

图1.高灵敏化学发光成像免疫分析示意图

图2.免疫传感芯片的制备及夹心免疫反应、信标结合反应及化学发光信号产生示意图