[发明专利]一种基于快速克隆技术的环状RNA表达载体构建方法及其应用

说明书

环状RNA在体内外过表达时不容易形成环状结构，目前多数过表达环状RNA方法中只有10%左右的形成率，即使改良的方法中提高了表达量，但会将原本不属于环状RNA的序列加入环状RNA中。本发明是一种基于一步法快速克隆的、人工改造的、可以完整高效地表达环状RNA载体的构建方法及应用。利用特殊的环状RNA过表达序列框架，上下游特异性序列，酶切位点，以及利用一步法（快速克隆法）插入环状RNA序列的方法，达到高效、完整、便利地克隆及过表达环状RNA。该方法及载体可以广泛应用于各种环状RNA的表达，为研究环状RNA的作用机制提供便利条件，为应用环状RNA作为体内基因靶向治疗、药物筛选提供基础。

技术领域

本发明属于分子生物学研究领域，所涉及的应用范围包括体内外过表达环状RNA分子的基础研究和用于体内过表达环状RNA基因靶向治疗的应用研究领域。具体定义为一种完整高效地过表达环状RNA序列的载体构建方法，序列结构及其应用。

背景技术

环状RNA( circular RNA，circRNA)是新近确认的一类特殊的非编码RNA( non-coding RNA，ncRNA)分子，通常由部分外显子或内含子环化而成的RNA 分子，因而其结构比普通线状RNA稳定。circRNA普遍存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性。circRNA是RNA 家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA 领域最新的研究热点。早期，关于circRNA 的文献报道少，且表达水平相对低，故在很长一段时间里，circRNA被认为是错误可变剪接( alternative splicing ) 而形成的副产品，属于自然界中一种极罕见现象，甚至被当做遗传意外或实验人为因素所致，并未引起学术界重视。随着RNA 测序和生物信息学等技术的快速发展，人们在大规模研究转录组数据时发现，circRNA并不像之前所认为的那样是一种极罕见现象，反而大量存在于真核细胞中。Danan 等发现，circRNA 在古生菌细胞普遍存在，并认为其极有可能具有生物学功能。同时，Salzman 等也证实circRNA 在人类细胞基因表达中是一个普遍现象，并可能扮演着多种生物学功能的重要角色。Jeck等采用高通量测序方法，在人成纤维细胞中检测到超过25000 种circRNA，认为circRNA 是RNA 剪切后所形成的一类极稳定的保守性产物，此外还发现circRNA可被小型干扰RNA( small interfering RNA， siRNA) 降解。Memczak 等研究证实circRNA 参与转录后调控，Hansen 等的研究则揭示circRNA 可作为miRNA 海绵( miRNA sponge) 来影响基因的调控与表达。尽管circRNA 被发现已有30 余年，但由于技术限制等原因，circRNA一直处于被学术界忽视的地位。但随着近年有关circRNA 的几项突破性研究的发现，尤其是国际著名权威刊物Nature 发表两篇有关circRNA生物学功能的论文，震惊学术界，从此拉开揭开circRNA 神秘面纱的序幕，circRNA 已引起国内外学术界的关注，并将掀起研究热潮。而Glazar 等建立了circRNA 专用数据库“circBase”，该数据库对目前已发表的circRNA 资料进行整合统一，同时提供已知的及新的circRNA 测序资料，旨在为circRNA的研究提供一个较好的交流平台。