[发明专利]一种定量检测血清中神经胶质纤维酸性蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属纳米材料、荧光免疫技术和生物分析检测领域，具体涉及基于碳点为荧光标记物的双抗体夹心定量测定血清中神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的方法。

背景技术

外伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是导致青少年和儿童死亡的主要因素。外伤性脑损伤包括不同等级的初始伤害和随时间以初始损伤点为核心的细胞死亡向周围组织传递损伤的过程。因此，需要建立一个检测外伤性脑损伤的合适方法。目前，诊断外伤性脑损伤的主要方法如下：核磁共振成像(MRT)、计算机断层扫描(CT)、弥散张量成像(DTI)和住院观察。然而现有的这些诊断手段都需要昂贵的仪器，在资源缺乏的地区难以实现，且在诊断过程中的辐射可能会损害病人的健康。研究表明外伤性脑损伤导致的脑细胞死亡会使各种脑内蛋白进入体液中，根据后创伤性脑损伤诱导释放各种生物标志物的模式和时间可以推测损伤的程度和结果。在各种创伤性脑损伤的生物标志物中，神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)仅在星形胶质细胞死亡后才释放，是脑组织中特殊的蛋白。Papa等的研究结果证实，随着脑损伤的加重，病人血清中的GFAP含量呈上升趋势。有研究表明，外伤性脑损伤患者血清中的GFAP含量与脑损伤的程度和后果具有明显的相关关系，是一个可以有效显示各种类型脑损伤的蛋白标志物。因此，很有必要发展一个准确及时、操作简便的测定血清中GFAP含量的方法用以诊断TBI。

血清GFAP定量检测方法主要有液相色谱法、电化学检测和酶联免疫吸附(Elisa)测定。Elisa方法是将检测抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接，通过HRP与其显色底物和过氧化氢的反应来间接测定GFAP的含量。随着研究进展，逐渐出现一些用荧光材料标记抗体替代HRP与底物反应的定量测定GFAP的方法。

目前应用的荧光材料主要是有机荧光材料、半导体量子点和荧光蛋白等。有机荧光染料因其粒径小、量子产率高在商业中得到广泛应用，但它的荧光不稳定，半导体量子点的重金属毒性限制了其在生物领域的应用，而荧光蛋白耐光漂白性差。近期发展的碳点(carbon dots，CDs)则弥补了这一缺憾，碳点不仅具有优越的荧光性能，荧光发射光谱窄而对称，具有激发光可调的特性，且量子产率高，耐光漂白，其良好的水溶性和生物相容性显示了其在生物检测方面的潜力。

CDs的合成路径主要分为两大类：自上而下和自下而上法。水热法是一种自下而上合成CDs的方法，操作简便，产率较高。CDs作为一个全新的荧光标记材料，已经成功应用在细胞内成像。在CDs成功应用于检测体外各金属离子之后，其在免疫分析方面的应用研究也有了很大进展。Wang等用适配体标记CDs检测沙门氏菌，Zhu等成功将IgG与CDs连接用于检测甲胎蛋白。

由于CDs稳定的荧光性能，其在替代传统荧光材料作为生物检测标记物方面具有很大的潜力。目前研究主要集中在碳点与适配体结合用于检测体系，与抗体结合用于检测的工作尚处在起步阶段，还未见有应用CDs结合抗体检测GFAP的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对上面所述的问题，提供一种基于CDs为荧光标记物的双抗体夹心定量测定血清中神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的方法，具有灵敏度高、检测简便的优点和免疫反应的高选择性、高亲和力的特点，可以直接应用于血清中GFAP的测定。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种定量检测血清中神经胶质纤维酸性蛋白的方法，步骤如下：

(1)、制备蛋白A/G琼脂糖纯化树脂连接抗体Ab1的复合物PA/G-Ab1；

(2)、制备碳点标记荧光探针CDs-Ab2：以柠檬酸为碳源，二乙烯三胺修饰合成碳点，将CDs在EDC、NHS的作用下，与多克隆抗体Ab2通过酰胺键共价结合，形成CDs-Ab2；

(3)、将步骤(1)所得PA/G-Ab1与血清内的GFAP特异性反应，将其从复杂基质中分离富集，形成PA/G-Ab1-GFAP；

(4)、将PA/G-Ab1-GFAP与CDs-Ab2相结合形成夹心结构PA/G-Ab1-GFAP-Ab2-CDs，用PBS溶液清洗至上清液无荧光后测试荧光强度，根据标准曲线，得到血清中GFAP的含量。

具体而言，各步骤具体如下：

(1)蛋白A/G琼脂糖纯化树脂连接抗体(PA/G-Ab1)制备：