[发明专利]一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种芸豆成分的检测方法，尤其是一种荧光PCR技术检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，属于化学检测技术领域。

背景技术

近年来，由于莲子价格的不断攀升，不少厂家为了节约成本会用芸豆馅料冒充莲蓉馅料。芸豆内除含有维生素、无机盐等营养成分外，还含有一种对人体有害的成分——血球凝集素，该成分经高温烹调后可被破坏。但是如果在芸豆加工过程中，烹调时间短或翻炒不均匀，致使芸豆不熟，可引起食物中毒。芸豆在消化吸收过程中会产生过多的气体，造成胀肚。故消化功能不良、有慢性消化道疾病的人应尽量少食。还有一些对豆类蛋白敏感人群，如误食豆制品，可能会引起过敏性皮炎或严重的会产生休克。这些不适宜食用芸豆类食品的人群若误食没有标示有芸豆成分的莲蓉月饼，可能会造成不可预计的严重后果。

芸豆的检测依据国家标准GB/T 23814-2009莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法，该方法为普通PCR法，主要过程为通过特异性基因序列扩增后用凝胶成像的方式鉴别，此法步骤繁琐，干扰因素较多，不利于批量检测。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，该方法反应快速、特异性强、灵敏度高、结果清晰，更适合实验室的批量和快速检测莲蓉制品中芸豆成分。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：

一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，依次包括下述步骤：

1)引物与探针设计合成

荧光PCR检测上游引物：ATGAATTGTACGGTGAAGGATGG；

下游引物：GGACTGTAAACAAACACAGGTAGC；

探针：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTGTCACCTCCA-3’-BHQ1，；

2)样品制备

将芸豆样品去皮烤干后用粉碎机打成粉末，其他物种样品均用粉碎机打碎后取样用于DNA的提取，莲蓉月饼样本取月饼馅料用于DNA提取；

取含1％芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍逐级稀释，使芸豆在混合样品中的含量为1％、0.1％、0.01％，用于重量灵敏度的测定；

3)DNA提取

将含有1％芸豆的样品、纯芸豆样品、随机抽取五批莲蓉月饼，取样量均为40±2mg，采用迪澳的植物基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行，用OSE-260型微量分光光度计测定DNA浓度；

4)实时荧光PCR反应

实时荧光PCR采用25μL反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸1μL，MgCl₂(25mmol/L)3μL，上、下游引物各0.07μL，探针0.05μL，Taq酶0.3μL，50％甘油0.2μL，模板DNA 5μL，补水至25μL；PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性5s，55℃退火60s，同时收集荧光，进行45个循环；

5)实时荧光PCR的特异性试验

选取白芸豆、红芸豆、花芸豆、黑芸豆、大豆、莲子、玉米、红薯、小麦、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作为PCR的模板，以去离子水为阴性对照模板，进行实时荧光PCR扩增，检测荧光引物的特异性；

6)实时荧光PCR的灵敏度试验

取白芸豆提取出的DNA模版进行稀释至1ng/μL，然后再进行一系列梯度稀释，将系列稀释的DNA模版进行荧光PCR扩增，测试荧光PCR法的检测灵敏度；取含1％芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍系列稀释，使芸豆在混合样品中的含量相当于1％、0.1％、0.01％，作为PCR反应得模板，进行实时荧光PCR扩增，测试方法的重量灵敏度；

7)芸豆PCR扩增

普通PCR反应体系：2×Es PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，去核糖核酸酶水7.5μL，模板DNA3μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸5min；

普通PCR扩增反应结束后，PCR扩增产物以2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并记录结果。

优选的，所述的一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，所述的脱氧核糖核苷三磷酸浓度为2.5mmol/L。

优选的，所述的一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，所述的MgCl₂浓度为25mmol/L。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：