[发明专利]一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法

权利要求书

1.一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)引物与探针设计合成

荧光PCR检测上游引物：ATGAATTGTACGGTGAAGGATGG；

下游引物：GGACTGTAAACAAACACAGGTAGC；

探针：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTGTCACCTCCA-3’-BHQ1；

2)样品制备

将芸豆样品去皮烤干后用粉碎机打成粉末，其他物种样品均用粉碎机打碎后取样用于DNA的提取，莲蓉月饼样本取月饼馅料用于DNA提取；

取含1％芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍逐级稀释，使芸豆在混合样品中的含量为1％、0.1％、0.01％，用于重量灵敏度的测定；

3)DNA提取

将含有1％芸豆的样品、纯芸豆样品、随机抽取五批莲蓉月饼，取样量均为40±2mg，采用迪澳的植物基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行，用OSE-260型微量分光光度计测定DNA浓度；

4)实时荧光PCR反应

实时荧光PCR采用25μL反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸1μL，MgCl₂3μL，上、下游引物各0.07μL，探针0.05μL，Taq酶0.3μL，50％甘油0.2μL，模板DNA 5μL，补水至25μL；PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性5s，55℃退火60s，同时收集荧光，进行45个循环；

5)实时荧光PCR的特异性试验

选取白芸豆、红芸豆、花芸豆、黑芸豆、大豆、莲子、玉米、红薯、小麦、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作为PCR的模板，以去离子水为阴性对照模板，进行实时荧光PCR扩增，检测荧光引物的特异性；

6)实时荧光PCR的灵敏度试验

取白芸豆提取出的DNA模版进行稀释至1ng/μL，然后再进行一系列梯度稀释，将系列稀释的DNA模版进行荧光PCR扩增，测试荧光PCR法的检测灵敏度；取含1％芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍系列稀释，使芸豆在混合样品中的含量相当于1％、0.1％、0.01％，作为PCR反应得模板，进行实时荧光PCR扩增，测试方法的重量灵敏度；

7)芸豆PCR扩增

普通PCR反应体系：2×Es PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，去核糖核酸酶水7.5μL，模板DNA3μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸5min；

普通PCR扩增反应结束后，PCR扩增产物以2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并记录结果。

2.根据权利要求1所述的一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，其特征在于，所述的脱氧核糖核苷三磷酸浓度为2.5mmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种检测莲蓉制品中芸豆成分的方法，其特征在于，所述的MgCl₂浓度为25mmol/L。