[发明专利]一种交叉淋巴毒实验的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种交叉淋巴毒实验的检测方法，它包含如下步骤：(1)取移植供者静脉抗凝全血以及移植受者的血清，从移植供者静脉抗凝全血中分离供者淋巴细胞；(2)取供者淋巴细胞液，染色标记，调整细胞浓度；(3)取冻干补体，溶解；(4)取5支反应管，依次加入供者淋巴细胞、生理盐水、阳性血清、受者血清这4种试剂中的2种或者3种，混匀，静置，再加入第5种试剂兔补体，再混匀，静置；(5)染色，上样。本发明还公开了一种交叉淋巴毒实验的检测试剂盒。本发明方法和试剂盒的毒性低、成本低廉，检测准确度高，临床应用前景优良。

技术领域

本发明涉及一种交叉淋巴毒实验的方法和试剂盒。

背景技术

交叉淋巴细胞毒实验即补体依赖的细胞毒实验(CDC)，用于同种异体器官移植前，判断受者对供者有无预存抗体。受者体内预存抗体可能由于多次输血、妊娠、二次移植等原因产生。如果受者体内有细胞毒抗体，可能在移植后引起超急性排斥反应，造成移植失败，因此在移植前检查受者血清中有无抗供者淋巴细胞抗体，是预防超急性排斥反应所必需的实验。

1969年,Patel和Terasaki发明了补体依赖的细胞毒实验技术,用于肾移植前急性和超急性排斥反应的筛查,直到今天,交叉淋巴细胞毒实验一直是移植前检查供体特异性抗HLA抗体的金标准。该实验技术也经历了许多改进，如抗人球蛋白-补体依赖性细胞毒法(AHG-CDC)以及除去血清中的IgM、利用流式细胞技术标记补体等方法改进实验的灵敏度和准确性。

目前最常用的交叉淋巴细胞毒实验是荧光染色检测方法，其原理是：供者活性淋巴细胞与受者血清共同孵育时，如果受者血清含有针对供者活性淋巴细胞特异性抗HLA循环抗体，则抗体上的结合到淋巴细胞抗原上形成抗原抗体复合物，在加入兔补体后激活一系列补体成分，导致淋巴细胞破坏死亡呈阳性反应。当加入荧光染色剂(含有丫啶黄与溴化乙啶)时，在荧光显微镜下活的淋巴细胞染成绿色，死亡淋巴细胞染成红色。

荧光染色检测方法通常通过微孔板法，所用材料为Terasaki微孔板，需要倒置荧光显微镜观察判断，存在如下3个缺陷：1、Terasaki微孔板为特制反应板，反应体系空间有限，不利于各实验组分的充分混合，反应，同时还容易造成在计数时由于细胞重叠带来计数和分型上的误差；2、倒置荧光显微镜价格昂贵，开展此项目检查的医院需花费几十万购买，限制了该实验方法的开展；3、采用的荧光染液含溴化乙啶，溴化乙啶具有致癌性，长时间使用可能会导致癌症的发生。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的交叉淋巴细胞毒实验的方法和检测试剂盒。

本发明交叉淋巴毒实验的检测方法，步骤如下：

(1)取移植供者静脉抗凝全血以及移植受者的血清，从移植供者静脉抗凝全血中分离供者淋巴细胞；

(2)取供者淋巴细胞液，染色标记，调整细胞浓度；

(3)取冻干补体，溶解；

(4)取5支反应管，按照下表依次加入前4种试剂中的2种或者3种，混匀，静置，再加入第5种试剂兔补体，再混匀，静置；

(5)染色，上样：

每管加入台盼蓝染色液或者中性红染色液，反应，将染好色的反应产物加入定量分析板中，用光学显微镜观察结果。

步骤(1)中，分离供者淋巴细胞的方法是：取移植供者静脉抗凝全血，加入生理盐水稀释，然后加入装有淋巴细胞分离液的试管内离心，吸取白膜层，加入PBS溶液混匀洗涤，离心，去上清，再加入PBS溶液混匀洗涤，离心，去上清，加入PBS溶液悬浮，即可。

优选地，所述生理盐水以及前两次PBS溶液用量与抗凝全血等体积；最后一次PBS溶液为抗凝全血体积的0.05倍；所述离心的转速是

1500～1800RPM。