[发明专利]一种交叉淋巴毒实验的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种交叉淋巴毒实验的检测方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取移植供者静脉抗凝全血以及移植受者的血清，从移植供者静脉抗凝全血中分离供者淋巴细胞；

(2)取供者淋巴细胞液，染色标记，调整细胞浓度；

(3)取冻干补体，溶解；

(4)取5支反应管，按照下表依次加入前4种试剂中的2种或者3种，混匀，静置，再加入第5种试剂兔补体，再混匀，静置；

(5)染色，上样：

每管加入台盼蓝染色液或者中性红染色液，反应，将染好色的反应产物加入定量分析板中，用光学显微镜观察结果。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，分离供者淋巴细胞的方法是：取移植供者静脉抗凝全血，加入生理盐水稀释，然后加入装有淋巴细胞分离液的试管内离心，吸取白膜层，加入PBS溶液混匀洗涤，离心，去上清，再加入PBS溶液混匀洗涤，离心，去上清，加入PBS溶液悬浮，即可。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述生理盐水以及前两次PBS溶液用量与抗凝全血等体积；最后一次PBS溶液为抗凝全血体积的0.05倍；所述离心的转速是1500～1800RPM。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述染色采用台盼蓝染色液或者中性红染色液染色；所述染色液的用量与细胞液等体积；调整细胞液中的细胞浓度为2×10⁹个/L。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述补体为兔补体；所述冻干补体用水溶解，置于2-5℃下放置20min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中，在供者淋巴细胞的加入量为5μl的情况下，各个试剂的加入量如下表：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中，每管加入台盼蓝染色液或者中性红染色液2ul，反应5分钟后将10ul染好色的反应产物加入Fast Read定量分析板中，用光学显微镜观察结果。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中，用光学显微镜观察时，阴性淋巴细胞为边缘整齐、光亮、未染色细胞；阳性细胞为边缘不齐、蓝色细胞，再进一步计算死细胞的百分率来判断阴性结果还是阳性结果：如果阳性细胞百分率在0—10％，1分，为阴性；11—20％，2分，阴性；21—50％，4分，弱阳性；51—80％，6分，阳性；81—100％，8分，强阳性。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(5)中，细胞对照、补体对照、血清对照的阳性细胞百分率应小于10％，阳性对照的阳性细胞百分率大于50％。

10.一种交叉淋巴毒实验的检测试剂盒，其特征在于：包含淋巴细胞分离液、细胞计数板空白板、兔补体、阳性血清、台盼蓝染色液或者中性红染液、PBS缓冲液以及生理盐水，当淋巴细胞分离液的溶液为50ml时，其余成分的用量为：