[发明专利]一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的专用培养基及培养方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基及培养方法。所述培养基包括按照比例混合而成的无血清培养基、脂多糖、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素‑4、青霉素‑链霉素；使用本发明DC培养基可稳定地诱导小鼠骨髓细胞高比例定向分化为未成熟树突状细胞，细胞生长状态良好，细胞数量、纯度及生物功能活性稳定，可以满足进一步实验需求，实验结果稳定，且本发明所述细胞培养基生产成本低，使用方便，具有实际的应用价值。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，更具体地，涉及一种未成熟树突状细胞专用培养基及培养方法。

背景技术

树突状细胞是一类存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，因其细胞膜向外伸出，形成树突状或伪足样突起，故而命名为树突状细胞(dendritic cells，DCs)。它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，并可刺激成熟后活化初始T 细胞。未成熟DC细胞具有较强的迁移、摄取和加工抗原的能力，而成熟DC细胞刺激初始T 细胞增殖、 分化的能力强，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。imDC成熟过程的深入研究有助于进一步阐明免疫耐受机制，对于抗肿瘤、风湿免疫免疫、抗排斥等临床和基础研究领域有极为重要的意义。

目前实验室imDCs的获取和培养多由研究者采用人外周血或脐血单个核细胞经抗体磁珠包被分离、Ficoll梯度离心纯化后诱导分化而成，采用基础培养基、动物血清及相关细胞因子自行配置培养。但由于临床血标本的限制、DC自身增殖能力不强，加之不同品牌培养基及血清等试剂之间差异较大、成分复杂，导致不能获取足量imDCs、培养效率低下、细胞活性差、每次获取imDCs的量及成熟度均不稳定，严重影响后续实验的准确性和可靠性。因此，在实验室中如何稳定高效的获取大量imDCs，是解决问题的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基。

本发明的第二个目的是提供利用所述培养基进行imDCs体外诱导分化的培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种诱导小鼠骨髓细胞稳定分化为未成熟树突状细胞的培养基，该培养基由X-VIVO 20 90～95v/v%，LPS 1μg/ml，GM-CSF 20～40ng/ml、IL-4 10～40ng/ml、青霉素-链霉素 10⁶U/ml组成，余量为无菌注射用水；其中GM-CSF与IL-4的质量比为4：1时DC产量及纯度最高。

本发明所述培养基包括按照比例混合而成的无血清培养基、LPS、GM-CSF、IL-4、青霉素-链霉素。

其中，无血清培养基为X-VIVO 20，其配方完全并且包含药物级别的人白蛋白、重组人胰岛素及巴氏消毒转铁蛋白，可以为细胞生长提供基本物质营养、激素及各种生长因子，所含结合蛋白、促接触和伸展因子能在细胞代谢过程中起重要作用，同时由于不添加血清成分、不含不明确成分，增加确定性，性能更加一致，容易进行纯化和下游加工，细胞功能的精确评估，增强生长和/或产量，生理反应性的较好对照，增强细胞内中介物的检测。

LPS是格兰氏阴性细菌内毒素的主要成分，LPS在DC分化发育的晚期促使其成熟，但在DC分化发育的早期或其全过程中持续予以一定剂量的LPS刺激，DC的成熟明显受到抑制。

GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，能定向刺激骨髓细胞向粒细胞-巨噬细胞方向分化，亦诱导单核扩增向DC方向分化。

IL-4为白细胞介素-4，能抑制骨髓细胞向巨噬细胞方向分化。两者结合，使得骨髓细胞更高比例的向DC方向分化。