[发明专利]一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖醛酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖醛酸的方法。

背景技术

葡萄糖醛酸，全称D-(+)-葡萄糖醛酸，英文名称为Glucuronic acid，是葡萄糖第6位上的羟基被氧化成羧基所形成的糖醛酸，其水溶液极不稳定，易自发转化为葡糖糖醛酸内酯。

葡萄糖醛酸天然存在于动植物及真菌中，具有重要的生物学功能。它可作为如D-葡萄糖二酸钙、L-抗坏血酸及抗炎症等医药的合成中间体；还可作为功能性饮料、化妆品等的添加剂，其在医药、食品、保健品工业中有广泛的应用。

目前葡萄糖醛酸主要通过化学法(硝酸氧化法)来生产，但其能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等限制了其大规模工业化生产。而发酵法，尤其是微生物发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也很小，并且以葡萄糖为底物发酵法生产葡萄糖醛酸可减轻原料来源的限制。

微生物发酵法是利用特定的菌株或生物酶对能形成葡萄糖醛酸物质或其前体的特定物质进行发酵来制备葡萄糖醛酸。目前对于生物发酵法生产葡萄糖醛酸的研究相对很少，但是生物发酵法具有成本低、环境污染小、特异性高等优点，利用特定的微生物菌株来发酵生产葡萄糖醛酸具有很高的生物应用价值。

大肠杆菌是单细胞低等原核生物，细胞容易培养、生长速度快、操作简单等。由于它培养时营养要求低、生长快、培养基廉价，因此是一种可用于生产目标产物产品的优良宿主。

目前尚未发现有通过重组大肠杆菌来发酵生产葡萄糖醛酸的报道，原始的大肠杆菌株并不能生产葡萄糖醛酸，鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌，在微生物发酵生产葡萄糖醛酸方面，提供了新的方法与思路。

发明内容

本发明通过在大肠杆菌中表达不同植物来源的肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇氧化酶基因(MIOX)，构建重组菌，该重组菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖醛酸。

本发明通过以下技术方案实现。

一种重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1和肌醇氧化酶基因MIOX。

优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于以下任意一种：酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、番茄(Solanaceae Lycopersicon 1706)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)。

进一步优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，在本发明的一种实施方式是来源于番茄(Solanaceae Lycopersicon 1706)。

优选的，所述肌醇氧化酶基因MIOX来源于以下任意一种：酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、番茄(Solanaceae Lycopersicon 1706)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)。

进一步优选的，所述肌醇氧化酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，来源于番茄(Solanaceae Lycopersicon 1706)。

优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列分别是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的序列。

优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1与肌醇氧化酶基因MIOX表达的蛋白质，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列分别是SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的序列。

优选的，所述重组大肠杆菌的出发宿主菌为大肠杆菌。

优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1和肌醇氧化酶基因MIOX为整合表达。

以上所述的一种重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括：将肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1和肌醇氧化酶基因MIOX连接到双元表达载体上转化到大肠杆宿主菌株，得到重组大肠杆菌。

优选的，该方法具体是:以番茄(Solanaceae Lycopersicon 1706)基因组为模板扩增MIOX基因、Ino1基因，并分别加上合适酶切位点，将片段连接到双元表达载体pETDuet1后，用化学法转化DH5α中，筛选获得正确的重组质粒，命名为pETDuet1-Ino1-MIOX，将重组质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，筛选正确的重组大肠杆菌，既得到重组大肠杆菌，命名为E.coli BL21(DE3)/Ino1-MIOX。