[发明专利]一种检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因的高通量分子标记及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的高通量分子标记及其应用。本发明所提供的高通量分子标记是用于检测萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的KASP引物，引物序列是SEQ ID1～3所述的核苷酸序列。本发明基于萝卜Ogura‑CMS育性恢复基因Rfo的序列设计高通量KASP专用引物，采用PCR SNPLine平台检测Rfo基因的基因型，具有操作流程全自动，通量高，适合大量样品同时检测。本发明用于萝卜Ogura类型细胞质雄性不育系的转育，可以大大节约时间和人力，提高育种效率。

技术领域

本发明涉及一套检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP标记引物及其应用，属于分子遗传育种技术领域。

背景技术

雄性不育系和自交不亲和系是萝卜利用杂种优势的两个主要途径。与自交不亲和系相比，雄性不育系具有两个明显的优势，一是可以提高杂交种的纯度，二是可以避免亲本的流失，从而保证育种家的利益。目前，在萝卜中发现了不同类型的雄性不育细胞质，如Ogura、金花薹48A、Kosena、NWB和DCGMS，其中应用最广泛且研究最深入的是Ogura雄性不育细胞质。

细胞质雄性不育系的转育是萝卜杂种优势利用和配制杂交种的关键，传统的回交转育方法费时费力，主要过程包括，获得萝卜Ogura-CMS不育源后，选择多个综合性状优良、配合力好的自交系做父本分别与不育源杂交；淘汰杂交后代全部为可育的自交系；对于杂交后代出现育性分离或全不育的自交系，可作为轮回亲本，以杂交后代或回交后代中的不育株做母本，进行6-7代连续回交，最终获得遗传背景相似的不育系和相应的保持系。

从分子水平上来说，萝卜Ogura-CMS属质核互作雄性不育类型，植株育性是由线粒体不育基因orf138和细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)相互作用控制的。在不育系中ORF138蛋白在线粒体内膜上积累，干扰其他线粒体基因(atp6、atp8、cox I等)的功能，导致雄性不育的发生。Ogura-CMS的育性可由细胞核内育性恢复基因(Rfo)恢复，该基因编码一种PPR蛋白，包含687个氨基酸，能够阻止花药绒毡层中ORF138蛋白的合成，从而使雄性不育系恢复育性(Desloire et al，2003)。

分子标记的开发将极大地提高不育系转育的效率，萝卜Ogura-CMS细胞核育性恢复基因orf687(Rfo)及相应的等位基因(rfo，没有恢复功能)的高效鉴定其中的关键技术。Yasumoto等(2008)根据不育系和恢复系中orf687(Rfo)基因序列差异开发了PCR-RFLP标记，并用于研究恢复基因在日本野萝卜中的分布频率。在此基础上，Sun等(2012)利用该标记应用于萝卜雄性不育系的辅助选择。但PCR-RFLP标记需要结合PCR扩增、限制性内切酶消化和凝胶电泳过程，不但对DNA质量要求较高、经常由于反应条件不稳定造成精确度降低，而且不能实现高通量、大样品的检测。KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)分型技术，能够对基因组中SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，具有灵敏度高、高通量、低成本、快速等优点，是目前国际上SNP分析的主流方法之一。因此，本发明开发了一种基于KASP分型技术的萝卜Rfo基因SNP分子标记并应用于萝卜雄性不育系的转育。

发明内容

本发明的目的之一是提供一套用于检测萝卜Ogura-CMS育性恢复基因Rfo的KASP专用引物。

本发明所述的KASP专用引物包括以下3条引物：

(1)引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTGCAGAAACATTTTATCAGAATG-3’；其由GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为标签序列A；