[发明专利]鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒及其方法和引物对。

背景技术

近年来，随着药典标准的提高，多种生化原料粗品需明确动物种属来源。2016年10月19日，国家食品药品监督管理总局发布《药品生产质量管理规范生化药品附录(征求意见稿)》，其中第四十条关于种属鉴别提到，生化药品的原材料来源应相对稳定，应明确动物的种属及器官组织。必要时对原材料的动物种属进行鉴别。此处的“动物”是指非人动物。目前动物来源的生化原料药物有100多种，主要来源是猪，其次是牛、羊、家禽等。

动物源性成分鉴别有物理学、化学、免疫学和分子生物学等方法。由于生产过程中的提取、纯化等工艺，不能用常规的理化方法来鉴别生化原料的种属来源，而分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)法具有快速、灵敏、特异性强的特点，已在肝素等生化药品或原料药的动物源性成分检测中有所应用。2014年FDA发布名为《多重荧光定量PCR检测原料药中反刍动物DNA用于监控肝素粗品质量》的指导原则，从肝素原料药中残留DNA的提取、纯化到反刍源性成分的实时荧光PCR检测各方面做了详细介绍。但鉴于肝素是一种多糖，指导原则中所述DNA提取方法不适用于蛋白类生化原料粗品，且指导原则所述方法仅可区分猪源性成分和反刍源性成分，而对于牛、羊等反刍源性成分无法进一步区分；另外，该实时荧光PCR检测试剂及实时荧光PCR检测仪的价格昂贵，并需要定期校准维护仪器，成本较高、难以在基层实验室推广使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的针对原料粗品中残留DNA的检测方法不能区分反刍类动物源性成分以及现有检测方法对仪器的要求高、试剂成本高，不利于大规模推广应用等缺陷，提供一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物、特别是偶蹄目动物源性成分的试剂盒、方法以及引物对。该试剂盒具有操作简便、成本低、准确性高以及重复性好等优点，特别能够区分猪及牛、羊等反刍类源性动物成分。

现有的动物来源的生化原料粗品的制备方法通常会残留动物的DNA，利用该DNA进行动物物种的鉴定成为本领域的常规技术。然而DNA的残留量不甚明确，如果直接进行DNA的提取，可能会因为含量过低，无法提取到有效量的DNA；而如果利用现有的灵敏度高、特异性强的荧光定量PCR又会存在检测成本高，不利于推广应用等缺陷，且其灵敏度过高，大大低于原料粗品中DNA的含量，造成不必要的浪费。因此选定合适的检测方法成为鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的难点，特别是在保证鉴定结果特异性高的条件下还需尽量保证灵敏度。本发明付出创造性劳动后发现，因前期处理工艺不同，蛋白类生化原料粗品中DNA的残留量的数量级可能经常会在1皮克以上，针对该残留量，只要引物设计合理则普通PCR的检测限度即可达到。故在确定检测方法后，需要确定能够区分偶蹄目中不同物种的特异性DNA；同时还需兼顾能达到上述灵敏度。经本申请发明人诸多试验和研究，从众多基因和DNA中筛选出上述动物中细胞色素氧化酶亚基I基因，该特异性DNA具有分子量小、结构简单稳定以及不与组蛋白结合因而裸露等特点；并且拷贝数多，可达数千到上万个的特点；基本符合本发明的上述要求。进一步地，又针对该基因设计并筛选出了特定引物对，进行普通PCR时也达到了上述最佳效果。

本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种鉴别蛋白类生化原料粗品中动物源性成分的试剂盒，其包括PCR反应体系，所述PCR反应体系至少包括一种引物对，所述的引物对针对所述动物、特别是偶蹄目动物的细胞色素氧化酶亚基I基因设计；其中，

针对猪细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ ID NO.1所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；

针对牛细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ ID NO.3所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；

或者，针对羊细胞色素氧化酶亚基I基因设计的所述引物对的正向引物是序列如SEQ ID NO.5所示的核酸，反向引物是序列如SEQ ID NO.6所示的核酸。

本发明中，上述蛋白类生化原料粗品指的是生物医药领域中，蛋白类生化药品的原材料。

较佳地，所述PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液、2’-脱氧核苷三磷酸和Taq酶；较佳地，所述PCR反应体系中Mg²⁺的浓度为2mM；4种所述2’-脱氧核苷三磷酸的浓度均为0.2mM；所述Taq酶的活力单位为0.025U/μl。