[发明专利]一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于基因诊断领域，具体涉及一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法。

背景技术：

人类白细胞抗原(HLA)基因位于人类第6号染色体短臂，是目前发现的人体多态性最高的基因。HLA基因分成三类：Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。其中，Ⅰ类包括：HLA-A、HLA-B、HLA-C基因；Ⅱ类包括：HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄清其系统的组成、结构和功能，阐明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。

2016年全国出生人数达1650万，随着计划生育政策的改变，预计2017年新生儿数量可达2000万，按照15％～20％的自然流产发生率来估算，到2017年我国发生自然流产的孕妇可达300万到400万人次。习惯性流产是指连续自然流产三次及三次以上者，自然流产者当中约1％为习惯性流产。目前，我国育龄夫妻每8对夫妻当中有一对就有不孕不育的情况出现，根据中国妇联报道数据显示，我国不孕不育患者数量已经超过5000万，不孕不育的原因很多，如染色体异常、内分泌失调、生殖器官解剖结构异常、细菌或病毒感染、母婴血型不合、环境污染等，其中由染色体异常导致的约占15％，故而在发生自然流产的原因中，染色体异常是其中一个重要的原因。在发生习惯性流产的病例中，夫妻双方或一方或胚胎染色体异常所致的流产，HLA区域拷贝数异常是比较重要的原因，因此，需要做HLA基因区域内的异常检测。

在HLA区域，共有4个主要位点A，B，C，D//DR，大量证据表明：习惯性流产的夫妇具有共同HLA抗原的频率较正常对照组显著增高，并发现与习惯性流产的抗原主要表现在HLA-D伞点上；配偶间D/DR抗原的相容性越高，习惯性流产的发生率也越大。另外，也有研究发现当夫妇高度共有HLA-A，HLA-B位点时，习惯性流产的发生率也明显高于正常对照组。目前，虽然PCR、高通量测序等拷贝数变异检测技术一直在发展，但是由于HLA区域DNA排列顺序的特殊性以及GC含量特征，不是任何一种拷贝数变异检测技术都适合，为此，针对HLA区域拷贝数变异检测的技术，申请人提供一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法。

发明内容：

本发明的目的旨在应用于习惯性流产检测技术领域，提供一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法，对即将要孩子的夫妻进行生育风险预警以及发生习惯性流产的患者找出病因，为产前诊断以确保优生优育具有重要作用。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法，包括如下步骤：

(1)采集人的组织、血液或其他体液基因组作为样品，将样品与CytoscanHD芯片进行杂交，杂交完成后对芯片进行洗涤，然后在GCD3000系统的数据收集系统中进行数据收集，生成CEL文件；

(2)将CEL文件输入CHAS软件进行初级质控，将质控合格的芯片生成的Cychp文件导入CHAS软件，根据拷贝数特征、marker数量以及CNV gain和CNV loss片段大小三个指标筛选出目的marker。

进一步地，步骤(1)中采集的样品与CytoscanHD芯片进行杂交之前经过标本采集、外周血基因组提取、DNA浓度与纯度测定和琼脂糖凝胶电泳质检基因组DNA获得质控良好的基因组DNA。

进一步地，将上述质控良好的基因组DNA经过酶切、连接、扩增、片段化并进行标记后，将通过质控的DNA与芯片进行杂交，优选地，杂交条件为50℃60r/min，杂交时间为16～18h。

进一步地，步骤(2)中导入CHAS软件的CNV片段大小以及marker数报告阈值设置为全区间。

本发明人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法，运用CytoscanHD芯片精确检测拷贝数变异的能力和结合CHAS软件直观且简化的分析流程，并通过对CHAS软件区间的特定设置，可以更加合理和准确地检测出HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D//DR的位点，由芯片杂交结果分析得到目的基因序列数据。因此，本发明的方法大大提高了检测HLA区域拷贝数变异的准确率，得到的数据更加可靠、真实，为预防习惯性流产和产前诊断得到了重要的保障。

附图说明：

图1是本发明人类HLA区域基因拷贝数变异检测方法的分析流程图；

图2是本发明实施例中芯片杂交图；