[发明专利]一种TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用

说明书

本发明TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用，包括如下引物和探针：(1)TMA反应引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；(2)分子信标探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示；(3)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明属于微生物学领域，本发明的试剂盒可以实现准确、快捷、高通量对临床常见致病细菌的检测，从而实现临床样本感染菌的快速鉴定，为临床细菌感染患者准备合理地进行抗菌药物治疗提供指导，进而避免抗生素的滥用，为患者节省宝贵的治疗时间。

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及方法。

背景技术

细菌感染是临床常见的感染性疾病，其发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。从临床样本中直接分离得到细菌表示感染严重需要立即进行抗菌治疗。不同的致病菌对药物种类和浓度的敏感性不同，治疗成功的关键在于早期应用合适足量的药物。而传统的检测致病菌的方法如显微镜检查、培养法、生物化学检查和免疫学方法等，由于各种因素的影响，通常需要几种方法联合使用，而且耗时也较长，需要1～3d，这期间用药不当往往使得患者病情加重或增加菌株耐药性。特别是在多种细菌联合感染的情况下，更增加了菌种鉴定和用药的复杂性。因此，建立一种快速且特异性强的微生物检测方法是十分必要的。

转录介导的核酸扩增技术(Transcription mediated amplification，TMA)是近年来发展起来的一种直接快速检测RNA的等温扩增技术，它克服了以往核酸扩增的不足，更为简便高效，尤其适用于RNA病毒的检测。高分辨率熔解曲线分析技术(High ResolutionMelting，简称HRM)，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。HRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。本试剂盒借用TMA技术和焦磷酸测序技术，开发了一种TMA-焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及方法，可以检测二十余种临床常见致病细菌。本试剂盒主要用于辅助临床医生诊断和治疗，其检测临床意义主要为：在进行细菌感染治疗时，合理正确地使用抗生素非常重要，而每种菌都有相应适用的抗生素，如果不能快速准确地鉴定细菌种类，就可能会导致手术治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用增加等。

发明内容

本发明的目的是提供一种TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒，以克服现有技术的不足，从而细菌感染患者科学用药提供依据和指导作用。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的引物和探针，包括如下序列：

(1)TMA反应引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；

(2)分子信标探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示；

(3)测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

具体TMA反应引物包括正向引物F1、F2和反向引物R1、R2；

所述正向引物F1和反向引物R1的碱基序列表示如下：

正向引物F1：5’-GAAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；