[发明专利]一种TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的试剂盒及其应用

权利要求书

1.TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序技术检测临床常见致病细菌的引物和探针，其特征在于，包括如下序列：

(1) TMA反应引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1~4所示；

(2) 分子信标探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5~7所示；

(3) 测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3 的5’端标记生物素；

SEQ ID NO.5的5’端标记荧光报告基团CY5，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；

SEQ ID NO.6的5’端标记荧光报告基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL；

SEQ ID NO.7的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。

2.TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括RNA提取试剂、2×TMA反应液、5×酶混合液、单链纯化试剂、测序试剂以及权利要求1所述的TMA反应引物、分子信标探针、测序引物。

3.根据权利要求2所述的TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂包括：裂解液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗脱液TE；

所述裂解液包括如下组分：2~8M胍盐、50~200mM Tris、0.5%~10%体积百分数的表面活性剂，所述胍盐为异硫氰酸胍或盐酸胍，所述的表面活性剂为Tween 20、NP40或者TritonX-100；

所述洗涤液Ⅰ包括如下组分：2~6M胍盐、50~200mM Tris、0.5%~10%体积百分数的表面活性剂，所述胍盐为异硫氰酸胍或盐酸胍，所述的表面活性剂为Tween 20、NP40或者TritonX-100；

所述洗涤液Ⅱ包括如下组分：10~100mM Tris、20~100mM EDTA、65~80%体积百分数的乙醇；

所述洗脱液TE包括如下组分：10mM Tris、1mM EDTA，pH8.0。

4.根据权利要求2所述的TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒，其特征在于，所述2×TMA反应液包括：0.4~1μM SEQ ID NO.1~4所示的寡核苷酸、0.05~0.5μM 3种分子信标探针、80mM Tris-HCl、24mM MgCl₂、140mM KCl、2 mM dNTPs、4mM NTPs和30%（V/V）二甲基亚砜。

5.根据权利要求2所述的TMA熔解曲线法联合焦磷酸测序法检测临床常见致病细菌试剂盒，其特征在于，所述5×酶混合液包括：200U M-MLV、1000U T7 RNA Pol和105μg BSA；

所述单链纯化试剂包含：75%(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6 三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液，链亲和素包被的磁珠；

所述测序试剂包含：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素和dNTP。