[发明专利]一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法

说明书

本发明公开了一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法。该方法包括如下步骤：a)提取植物及其叶际内生菌总DNA；b)以总DNA为模板，采用引物对1(序列1和序列2)进行第一次PCR扩增，得到PCR产物1；以所述PCR产物1为模板，采用引物对2(序列3和序列4)进行第二次PCR扩增，得到PCR产物2；(c)对所述PCR产物2进行测序，根据测序结果鉴定菌种，从而解析植物叶际内生细菌菌群结构。本发明打开了植物叶际内生细菌非培养法研究的大门，使得该领域的后续研究成为可能，并为整个植物叶际内生细菌研究领域提供了借鉴。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法，特别涉及一种利用嵌套PCR技术解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法。

背景技术

植物内生菌是指定殖于植物组织内的微生物，包括内生真菌和内生细菌，在植物生长发育的整个生命历程中，植物内生菌调节宿主植物的营养状态、参与宿主植物对环境胁迫(包括生物因素和非生物因素)的响应。

水稻是全球范围内最重要的粮食作物之一，对水稻内生菌的研究将为水稻营养、抗病等相关研究提供借鉴和指导意义。对于植物共生菌群的研究，目前主要集中于对其根际微生物的关注，水稻也不例外。从分子水平分析，PCR扩增中植物DNA对内生细菌16S rDNA的干扰是主要原因之一。植物细胞中线粒体和叶绿体两种细胞器均含有DNA，其中，线粒体的18S rDNA和叶绿体的16S rDNA与细菌菌种测序鉴定所用的细菌16S rDNA序列同源性非常高。植物根细胞只有线粒体，而地上部分绿色组织既有线粒体又有叶绿体，对菌群测序鉴定的干扰更大，很难同时排除该两种干扰。因此，目前还没有成熟的方法来解析植物叶际内生细菌的菌群结构。

就水稻而言，水稻是一种单子叶草本植物，植株结构简单，主要由地上部分的叶和地下部分的根组成。水稻内生菌的研究也可以由此分为根际菌群和叶际菌群两个方向。目前，水稻叶际菌群的研究远少于根际菌群，根据Web of Science的检索结果，水稻叶际菌群的研究仅停留在对叶片表面非定殖细菌的研究上，而水稻叶际内生细菌的研究目前还是空白，主要原因就是缺少叶际内生细菌的测序方法。

16S rDNA是细菌分类鉴定的分子钟，16S rDNA测序是目前微生物群落多样性测序的常用方法。16S rDNA存在于所有生物中，而且结构和功能高度保守。结构上，16S rDNA长约1.5Kb，由序列恒定区和序列可变区交替排列组成，因此，在应用上，可以根据16S rDNA的的序列恒定区设计引物，扩增出含有几个可变区的序列片段，然后根据可变区的序列特异性进行菌种的分类鉴定。16S rDNA测序结合二代测序技术平台，从而实现对菌群多样性的深度解析。水稻叶际内生细菌的测定也需要采用16S rDNA测序，但是问题如前文所述，水稻叶肉细胞中线粒体DNA和叶绿体DNA的存在使得扩增产物中这两种干扰占到90％以上的比例，细菌的序列信息几乎被覆盖掉，严重影响测序后数据的分析及分析质量的科学性。

目前，急需一种水稻叶际内生细菌的测序方法来开展水稻叶际内生细菌的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法。

本发明所提供的解析植物叶际内生细菌菌群结构的方法，是基于嵌套PCR技术的，具体可包括如下步骤：

(a)提取植物及其叶际内生菌总DNA；

(b)以步骤(a)提取的总DNA为模板，采用引物对1进行第一次PCR扩增，得到PCR产物1(16S rDNA的V3-V8区)；以所述PCR产物1为模板，采用引物对2进行第二次PCR扩增，得到PCR产物2(16S rDNA的V5-V7区)；

所述引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。