[发明专利]一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法

权利要求书

1.一种解析水稻叶际内生细菌菌群结构的方法，包括如下步骤：

（a）提取水稻及其叶际内生菌总DNA；

（b）以步骤（a）提取的总DNA为模板，采用引物对1进行第一次PCR扩增，得到PCR产物1；以所述PCR产物1为模板，采用引物对2进行第二次PCR扩增，得到PCR产物2；

所述引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；

（c）对所述PCR产物2进行测序，根据测序结果鉴定菌种，从而解析水稻叶际内生细菌菌群结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，所述提取水稻及其叶际内生菌总DNA的方法包括如下步骤：

（a1）取水稻叶片，去除表面细菌后进行液氮研磨；

（a2）取液氮研磨后样品，加入TE缓冲液；

（a3）加入SDS和蛋白酶K；

（a4）加入RNA酶，37℃温浴1-2h；

（a5）加入浓度为5M的NaCl溶液，混匀后再加入CTAB/NaCl溶液，混匀后65℃温育10min；

所述CTAB/NaCl溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.7M NaCl，100g/L CTAB；

（a6）对步骤（a5）所得样品依次进行DNA抽提、DNA沉淀和DNA溶解，从而获得所述水稻及其叶际内生菌总DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，所述TE缓冲液、所述SDS、所述蛋白酶K、所述RNA酶、所述浓度为5M的NaCl溶液和所述CTAB/NaCl溶液的配比为567μl：3mg：0.76U：200μg：100μl：80μl。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤（b）中，进行所述第一次PCR扩增和所述第二次PCR扩增时，所采用的DNA聚合酶均为高保真KOD Plus。

5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤（b）中，进行所述第一次PCR扩增时，所采用的退火温度为63℃；进行所述第二次PCR扩增时，所采用的退火温度为54℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（b）中，进行所述第一次PCR扩增时，所采用的扩增程序为：95℃ 3min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 1min06s，30个循环；72℃，10min；

进行所述第二次PCR扩增时，所采用的扩增程序为：95℃ 3min；95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃，10min。

7.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤（b）中，进行所述第一次PCR扩增时，设置多个重复。

8.成套引物对：由引物对1和引物对2组成；所述引物对1由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。

9.权利要求8所述成套引物对在解析水稻叶际内生细菌菌群结构中的应用。