[发明专利]一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种白蛋白结合肽‑人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段，所述融合蛋白不仅延长了重组人睫状神经营养因子的体内半衰期，还维持其活性。所述融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，纯化工艺简单，可用于大规模工业化生产制备药用级的融合蛋白纯品。与重组同源人睫状神经营养因子(rhCNTF)本身相比较，本发明所获得的ABD‑CNTF融合蛋白表现出血清半衰期显著延长，且保持人睫状神经营养因子的体外生物活性，从而改善了药物动力学和药效。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种长效生物药物开发领域，具体涉及一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

睫状神经营养因子(Cilinary Neuronotrophic Factor,CNTF)是一种多功能细胞因子。天然CNTF含200个氨基酸，分子量23KDa，等电点5.8左右，无N-糖基化位点和信号肽。CNTF可以促进包括运动神经元、感觉神经元、交感神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。临床试验表明，CNTF有望成为治疗帕金森(Parkinson disease,PD)、阿尔茨海默(Alzheimer's disease,AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(AmyotrophicLateral Sclertosis,ALS)等神经退化性疾病的药物。

最近研究表明CNTF可作用于位于下丘脑区域的受体，抑制机体对食物摄取的欲望，能使肥胖实验小鼠(ob/ob mice)脂肪减少，进而体重降低。对于具有瘦蛋白(leptin)抵抗能力的食物诱导肥胖小鼠(diet-induced obesity,DIO)模型，CNTF也能起到减少摄食、减轻体重的作用。针对这一结果进行在肥胖症领域进行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，抑制进食欲望且不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉、促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。在神经系统、肌肉系统、肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。

由于CNTF在治疗或预防肥胖症及其相关疾病中存在半衰期短的缺陷，限制了其在临床上的使用。因此，为了开发长效型CNTF制剂，目前现有技术使用PEG类聚合物对CNTF进行修饰，延长药物在体内作用的时间。以PEG修饰技术作为基础的长效策略存在修饰过程复杂、修饰产物分离困难和修饰后蛋白活性显著降低等问题。

人血清白蛋白(HSA)是血液中最丰富的蛋白质，在人体内半衰期为19天。人血清白蛋白的长半衰期及稳定性为长效药物的设计提供了一种理想的载体。CN 101200503A公开了一种血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，该融合蛋白既有干扰素的特性，半衰期又得到了延长。当前基于白蛋白的长效策略主要是与白蛋白直接融合表达或通过化学偶联的方法与白蛋白结合在一起，基于这些策略已经取得良好的研究进展，并且相关产品已经相继被FDA批准。

白蛋白结合肽(albumin binding domain，ABD)是一种与白蛋白具有高亲和力的多肽，包括源自微生物天然蛋白序列筛选获得的结构域，如链球菌G蛋白中与白蛋白结合的结构域以及人为设计获得的白蛋白抗体中抗原结合结构域。通过噬菌体展示技术筛选出的多种ABD肽均具备白蛋白结合位点，且具有极高的白蛋白亲和性能，在血浆循环中可与血浆白蛋白特异性结合，从而借助白蛋白在体内的长效性实现长时循环。通过融合表达或者化学修饰引入这种能与白蛋白结合的结构域，利用内源性的白蛋白作为载体可实现药物的长效性。

ABD是一个小分子的肽段，与其它蛋白融合后仍然可以在原核表达系统中进行表达。因此，与直接融合或交联完整白蛋白分子相比，融合或交联ABD可以避免使用复杂的CHO等表达系统，同时也可避免外源性白蛋白所带来的安全隐患。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白具有高生物活性，体外活性保持较好，且具明显延长的体内半衰期。