[发明专利]一种可进行多物种分子标记的单引物及其标记方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种可进行多物种分子标记的单引物及其标记方法。

【背景技术】

DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接在DNA水平上检测生物个体之间的差异，能够从DNA水平直接反映生物的遗传本质，是生物个体DNA水平上遗传变异的直接反映。它具有数量丰富、信息量大、多态性高、检测不受季节、环境和个体发育阶段的影响、检测手段简单迅速等优点，已被广泛应用于遗传多样性分析、亲缘关系评价、分子指纹图谱构建、遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位与克隆和分子标记辅助选择育种等领域。

自1980年首次提出分子标记的概念以来，有关DNA分子标记的研究不断有文献报道，特别是上世纪90年代以来，发展十分迅速。常规的DNA分子标记技术是使用一对引物进行PCR扩增的，而有一大类DNA分子标记技术只使用一条单引物进行PCR扩增，也被称为基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术。单引物扩增反应是指在一个PCR反应中只使用一条单引物，这一条单引物同时充当上游引物和下游引物的作用，当这一条单引物在基因组DNA上的两结合位点之间的距离不是很远的时候，两结合位点之间的序列便可得到有效扩增。自上世纪90年代以来，越来越多的基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术被开发出来并得到越来越多地关注和应用，比如RAPD(Williams et al.,1990)、ISSR(Zietkiewicz et al.,1994)、ISTR(Rohde 1996)、IRAP(Kalendaret al.,1999)、IMP(Chang et al.,2001)、SCoT(Collard and Mackill 2009a；熊发前等，2009)、CDDP(Collard and Mackill 2009b；熊发前等，2010b)、iPBS(Kalendar et al.,2010)、HFO-TAG(Levi and Wechter 2010)和CBDP(Singh et al.,2013)。这些基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术的技术核心是单引物的设计。其中，RAPD技术中所使用的单引物是完全随机设计的；ISSR技术中所使用的单引物是根据简单重复序列(SSR)来设计的；ISTR技术和IRAP技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中的LTR序列来设计的；IMP技术中所使用的单引物是根据MITE转座子中的TIR序列来设计的；SCoT技术中所使用的单引物是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性序列来设计的；CDDP技术中所使用的单引物是根据不同物种中同时存在的保守DNA序列或蛋白质序列(如转录因子WRKY、MYB、ERF、KNOX和开花控制MADS-BOX及生长素结合蛋白ABP1)来设计的；iPBS技术中所使用的单引物是根据LTR反转录转座子中毗邻5’LTR序列的保守性的tRNA结合位点(Primer Binding Site，PBS)序列来设计的；HFO-TAG技术中所使用的单引物是根据存在于大量西瓜的Unigenes中的长度为8-10bp的高频率短序列来设计的；CBDP技术中所使用的单引物是根据植物启动子中存在保守一致序列“GGCCAATCT”来设计的。总之，自上世纪九十年代以来，DNA分子标记技术的开发及应用进展十分迅速，新的DNA分子标记技术不断出现，基于单引物扩增反应的DNA分子标记技术也在同步涌现。一般来说，后面出现的DNA分子标记技术大都吸收了前面的优点且克服了它们的部分不足，使之不断优化，但现有的DNA分子标记技术的缺陷仍然存在，如引物设计较复杂、引物数量较少、引物通用性不强、引物退火温度较低、引物扩增重复性较差和引物趋向于非功能编码区域扩增等缺点。

本发明的第一发明人在2015年申请了一项中国专利，专利号为：CN 104946742A，公开了一种针对真核生物基因组中基因外显子区域设计合成的单引物，该引物具有设计简单、合成费用较低、通用性强、利用率高、退火温度较高、扩增重复性较好、产生的多态性较丰富等特点，但该申请并没有公开针对真核生物基因组中基因内含子区域或调控区域设计合成的单引物，但并没有公开利用基于基因内含子区域或调控区域设计的单引物进行多物种分子标记分析的技术。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种可进行多物种分子标记的单引物及其标记方法，该引物针对真核生物基因组中基因内含子区域或调控区域设计合成，具有设计简单、合成费用较低、通用性强、利用率高、扩增效率高和产生的多态性丰富等特点。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：