[发明专利]一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法

说明书

技术领域

本发明属于基因甲基化检测领域，特别涉及一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法。

背景技术

DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C)5位碳的甲基化，形成^m5C。哺乳动物DNA中，呈甲基化状态的碱基对^m5CG会对基因的表达起到限制作用。

近年来的研究发现，DNA甲基化与恶性肿瘤发生与发展密切相关。DNA甲基化水平在肿瘤发生发展中的改变主要表现为局部高甲基化和基因组的低甲基化。首先是抑癌基因的启动子区，在正常细胞中该区域处于低甲基化或者未甲基化状态，基因可以正常表达，从而不断的抑制肿瘤发生。而在癌细胞中，基因的启动子区域会呈现高度甲基化状态，抑制了基因的表达，并最终导致癌症的发生。其次是对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，其甲基化水平降低将造成这些基因的激活，细胞过度增殖，并最终导致癌症。

传统甲基化检测方法中，基于测序的方法虽然检测结果往往被视为金标准，但其过分依赖于昂贵的仪器和复杂的操作过程，且无法检测出微量甲基化拷贝。而另一些方法，例如甲基化特异性高分辨率溶解曲线法，荧光定量PCR法等，虽然简便快捷，但检测结果不够精确，灵敏度不够高。以上这些缺点都限制了上述检测手段在实际临床检测中的应用价值。

数字PCR芯片技术，作为一种能够精确检测到单个DNA分子的技术，具有很多优点。例如：

一、能够对起始样品进行绝对定量，而不需要依赖标准品，不需要预先绘制标准曲线。

二、灵敏度高，检测限能够达到10¹数量级个拷贝。

三、可以精确定量小拷贝数变化，准确识别DNA分子的微小浓度差异。

这些优点都使得数字PCR芯片具有比传统定量方法更优越的性能，从而更加适用于生化检测。

甲基化敏感性限制性内切酶，是一类能够特异性识别其切割位点甲基化状态的限制性内切酶，当其切割位点状态为甲基化时，切割不发生。当其切割位点状态为非甲基化时，切割发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，该方法实现了对基因甲基化程度绝对定量的方法，该方法能够准确的定量出待检测基因的甲基化拷贝数所占的百分比；检测灵敏度高；检测过程简单；且检测时间短。

本发明的一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：

(1)针对待检测的目的基因，确定富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域，并对该区域设计引物与taqman探针；

(2)将待检测样本分成两份，其中一份经甲基化敏感性限制性内切酶处理，另一份不处理；

(3)利用数字PCR芯片分别对两份样本进行定量检测，最终计算出样本中目的基因的甲基化程度。

所述步骤(1)中的taqman探针两端分别修饰FAM荧光分子和BHQ荧光淬灭剂分子。

所述步骤(3)中的数字PCR芯片为采用PDMS制作的阵列式数字PCR微流体芯片。

采用PDMS制作的阵列式数字PCR微流体芯片不依赖专用的数字PCR设备，分液和读取均在芯片上完成，大大降低了甲基化的数字PCR检测成本。

所述步骤(3)中的PCR芯片反应体系为：10μL罗氏480probs master mix，0.5μL浓度为10μM前引物与后引物，0.5uL浓度为10μM的taqman探针，并加水至总体积为20μL。

所述步骤(3)中的计算方法为：统计两份样本中的拷贝数，从未经处理的样本的定量结果得到甲基化与非甲基化等位基因总数，从经处理的样本的定量结果得到样本中的甲基化拷贝数，两者相除，最终得到样本中甲基化等位基因的百分比，即样本的甲基化程度。

本发明的技术方案具体为：

第一步：欲检测的目的基因寻找到富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域设计特异性引物与taqman探针。首先，确定要研究的目的基因相应的区域，在该区域中找到富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的序列，以该序列为模板进行引物设计，并同时设计出相应的taqman探针。

第二步：对样本进行限制性内切酶处理。待检测样本为从细胞，组织，血液等中提取的DNA，将待检测样本均分为相等的两份：A部分与B部分。B部分中按照相应的甲基化敏感性限制性内切酶的使用说明，将B部分样本进行限制性内切酶处理，B部分样本中的非甲基化拷贝将被限制性内切酶切割消化，只剩下甲基化拷贝。A部分不使用甲基化敏感性限制性内切酶处理。两部分样本在进行完上述步骤后保存待用。