[发明专利]sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌及构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物学领域，涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌，具体来说是一种sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌及构建方法。

背景技术：

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种非芽孢的革兰氏阳性菌，它是一种可以引发李斯特病的食源性致病，广泛寄生于土壤、污水、人和动物的粪便、饲料及肉类、蛋类、禽类等食品中。单核增生性李斯特菌在感染过程中可以穿透肠道屏障，胎盘屏障和血脑屏障，从而导致人体产生肠胃炎，脊髓炎，脑膜炎等一系列疾病。在其侵袭宿主的过程中，很多毒力基因及毒力蛋白发挥着重要的作用。LLO(Listeriolysion O)是一种多功能的毒力因子，在形成穿孔毒素及宿主细胞黏膜外渗方面起着重要的作用；由actA基因编码的膜蛋白ActA与Lm的肌动性运动有关，inlA和inlB是内化素蛋白家族中最重要的内化素蛋白，是最早被发现的介导Lm入侵宿主细胞的内化素。plcA和plcB有助于Lm逃离吞噬小体，prfA主要调控Lm的侵袭相关毒力因子，如inlA和inlB等。这些毒力基因互相影响，共同促成了Lm对宿主的侵袭和感染。

越来越多的证据表明Lm可以抵抗来自外界的多种压力，包括加热，冷冻，氯化钠，渗透压，pH，氧化物以及紫外线(UV)辐射等，使得Lm在各种乳制品、肉制品等各类食品加工过程及冷链运输过程中存活并引发李斯特病。因此，深入了解Lm的抗性系统将会对控制这种致病菌的传播起到重要的作用。有研究表明sigB基因在Lm抵抗外界压力方面起着关键作用，sigB基因的编码产物sigmaB因子是对环境胁迫产生应答反应的主要调控因子，RsbV和RsbW两个关键蛋白是sigmaB因子活性调控中最重要的两个关键蛋白，当细菌出路非压力环境下，RsbW蛋白能使RsnV磷酸化，从而使得sigmaB活性受到抑制；当外界压力信号传递到细胞内时，RsbV去磷酸化并结合RsbW蛋白上，促使其释放出sigmaB因子，激活的sigmaB因子进而装载到RNA核心酶上，从而诱导依赖sigmaB的基因转录，来抵抗来自外界的压力。sigB基因通过直接或间接对Lm重要毒力基因的调控起到了其在Lm侵袭宿主时毒力因子的作用，在受sigma因子调控的54个被鉴定的基因中，至少有3个基因属于毒力相关基因，如编码胆碱水解酶的bsh、编码与RNA结合的调控蛋白的hfq、以及编码渗透转运蛋白的opuC。在以一定程度上，毒力基因inlA和毒力基因调控蛋白prfA的编码基因prfA也受其调控。另一方面，菌膜被认为是Lm抵御外界压力所形成的一种保护膜，sigB基因与Lm菌膜的形成有着非常重要的关联。通过联系抵御环境压力及调节其他毒力基因这两方面，sigB基因在Lm在自然界的存活及侵袭宿主方面都有着非常重要的作用。

发明内容：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌及构建方法，所述的这种sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌及构建方法要解决现有技术中没有合适的单核细胞增生李斯特氏菌用于减毒疫苗的技术问题。

本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失sigB基因。

进一步的，所述的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：CCTCC M 2016522。

本发明还提供了一种疫苗，含有上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。

本发明还提供了一种抗体，由上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。

本发明还提供了上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，包括如下步骤：

1)挑取EGD-e单菌落过夜摇床培养，采用细菌基因组提取试剂盒获得EGD-e基因组；

2)使用设计的引物sigB 5’F/sigB 5’R、sigB 3’F/sigB 3’R，以EGDe基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到sigB基因的上游片段P1/P2和下游片段P3/P4，上游片段P1/P2的序列如SEQ ID NO.7所示、下游片段P3/P4的序列如SEQ ID NO.8所示，使用限制性内切酶XbaI酶切得到的上下游片段，使用T4 DNA连接酶连接，连接完成后连接T载体并导入JM109感受态细胞中；

3)将阳性克隆的菌液转接扩大培养并抽提质粒；

4)通过SmaI和SalI两种内切酶分别对连有同源臂的T载体和穿梭质粒pKSV7进行双酶切，并用T4连接酶连接两种产物并导入JM109感受态细胞中；