[发明专利]sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌及构建方法

权利要求书

1.一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失sigB基因。

2.根据权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：所述的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：CCTCC M 2016522。

3.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。

4.一种抗体，其特征在于：由权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。

5.权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)挑取EGD-e单菌落过夜摇床培养，采用细菌基因组提取试剂盒获得EGD-e基因组；

2)使用设计的引物sigB 5’F/sigB 5’R、sigB 3’F/sigB 3’R，以EGDe基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到sigB基因的上游片段P1/P2和下游片段P3/P4，上游片段P1/P2的序列如SEQ ID NO.7所示、下游片段P3/P4的序列如SEQ ID NO.8所示，使用限制性内切酶XbaI酶切得到的上下游片段，使用T4DNA连接酶连接，连接完成后连接T载体并导入JM109感受态细胞中；

3)将阳性克隆的菌液转接扩大培养并抽提质粒；

4)通过SmaI和SalI两种内切酶分别对连有同源臂的T载体和穿梭质粒pKSV7进行双酶切，并用T4连接酶连接两种产物并导入JM109感受态细胞中；

5)将阳性克隆的质粒抽提后进行SmaI和SalI两种内切酶双酶切，得到sigB基因缺失的单核细胞增生李斯特氏菌。