[发明专利]用于制备柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的核酸构建体和方法

说明书

本发明属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本发明还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本发明还涉及一种串联共表达柯萨奇病毒A16型衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的方法以及纯化方法、一种制备柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒的方法等。进一步地，本发明还涉及一种柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。本发明实现了人手足口病病毒(柯萨奇病毒A16型)衣壳蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，并且表达量较高，最终获得的目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的10％，其组成的柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒与天然的柯萨奇病毒A16型构象高度接近。

技术领域

本发明属于分子生物学、病毒学和免疫学领域，涉及一种用于制备柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒的核酸构建体和方法。本发明还涉及包含所述核酸构建体的重组载体和重组宿主细胞。本发明还涉及一种串联共表达柯萨奇病毒A16型衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的方法以及纯化方法、一种制备柯萨奇病毒A16型的病毒样颗粒的方法、以及一种制备手足口病疫苗的方法。此外，本发明还涉及上述核酸构建体、重组载体或者重组宿主细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗柯萨奇病毒A16型感染或者柯萨奇病毒A16型感染所致疾病(例如手足口病)的药物特别是疫苗中的用途。进一步地，本发明还涉及一种柯萨奇病毒A16型病毒样颗粒以及含有它的药物组合物例如疫苗。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)又称肠病毒，是一种主要生长于肠道的RNA病毒，常见的肠病毒有：柯萨奇病毒(Coxsackievirus)包括A型23种与B型6种，Echovirus伊科病毒31种，和造成小儿麻痹症的Poliovirus脊髓灰质炎病毒3种，以及不分类的肠病毒68～71型，共67种。近年在亚洲和北美洲流行、可以引起手足口病的柯萨奇病毒A16型就是其中的一种。2014年8月开始在美国中部10多个州区域爆发，已感染上千名儿童的EV-D68肠病毒也是其中的一种。各型之间无交叉保护反应。而1994年英国最大一次手足口病流行是由柯萨奇病毒A16型引起的。柯萨奇病毒A16型的流行分布广、发病人数多，常常占到手足口发病的60％，其次是肠病毒71型。

其中柯萨奇病毒A16型是直径为23到30nm的正20面立体对称的球形颗粒，无包膜和突出。其核酸为单股正链小RNA病毒，其基因组含有大约7410个核苷酸。RNA中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5′和3′非编码区(UTRs)。如同其他肠道病毒属成员一样，柯萨奇病毒A16型基因组编码分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、VP2、VP3和VP4，构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位组装成病毒的外壳。VP1-VP3分布在病毒外壳表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部RNA结合。抗原决定簇基本上位于VP1和VP3上。而VP1蛋白由891bp的核苷酸所编码的297个氨基酸构成，包含病毒主要的中和抗原表位，也是血清学定型和基因型分型的主要依据。

手足口病主要发生在10岁以下儿童，5岁以下儿童风险最高，年龄小的儿童比年龄大的儿童症状更严重，青少年和成人也可感染手足口病。手足口病有周期性流行的趋势。柯萨奇病毒A16型感染引起的手足口病可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。近年来，包括柯萨奇病毒A16型在内的肠病毒引起的手足口病新发疫情令人担忧。在2011年报告了160万手足口病病例，其中509例死亡。

在中国，手足口病灭活苗III期临床数据显示，中国研发的手足口病病毒(EV71)灭活苗有很好的保护效果，这为大规模预防和控制手足口病毒的蔓延和爆发奠定了基础。但由于病毒毒力返强、病毒灭活不彻底、活病毒逃逸等不安全因素，灭活疫苗中残存的活病毒在理论上有可能会造成手足口病的泛滥。而且，对应柯萨奇病毒A16型，目前没有任何疫苗产品。